Bu yöntem, EYFP etiketli CENP-A proteininin ubiquitylation'ını belirlemeyi mümkün kAlmaktadır. Ayrıca farklı testler ve diğer proteinler ile insan CENP-A protein uygulanabilir. Bunun en büyük avantajı, çok önemli biyolojik önemi olan EYFP CENP-A K124R her yerde bulunan siteleri tanımlamak için kullanılabilmedir.
Çok çeşitli fonksiyonel proteinlerin çeviri sonrası modifikasyonlarını araştırmak için genişletilebilir. Protein hazırlayarak başlayın Anti-GFP antikor ile bağlı boncuklar. Yıkama 25 protein Etanol kaldırmak için tampon A1 ile immünopremasyon reaksiyonu başına boncuk lar.
Sonra tampon A1 ile% 50 boncuk çözüm yapmak. Boncuklara iki mikrolitre anti-GFP antikor ekleyin. Ardından arabellek A1'i net boncuk hacminin 20 katına ekleyin. Dört ila 18 saat boyunca dört santigrat derecede uç-uç döndürme gerçekleştirin.
Rotasyon için en uygun süre immünopresipitasyonun etkinliğine göre ampirik olarak belirlenmelidir. Döndükten sonra boncukları 100 kez g'de bir dakika santrifüj edin ve bağlanmamış süpernatantı çıkarın. Boncuk% 50 çözüm yapmak için tampon A1 ekleyin ve her immünopresidreaksiyonu için bu çözeltinin 25 mikrolitre kullanın.
İmmünenenan,liyada hücrelerinin sonication ve freeze/hawai ile tampon A1'de yer alan hücreleri gerçekleştirmesi. Protein konsantrasyonlarını ölçün ve farklı IP örnekleri arasındaki protein miktarlarını normalleştirin. Ardından, SDS sayfasında çalıştırmak için her tüpten numunenin %5'ini çıkarın.
Lysat'ın geri kalanını 25 mikrolitre proteinle karıştırın Anti-GFP antikora bağlı boncuklar ve dört ila 18 saat boyunca dört santigrat derecede uçtan uca dönüş yapın. Tampon A'daki hücreleri lysing ve daha önce açıklandığı gibi immünopresipitasyon yaptıktan sonra, TOPLAM immünopprepititantların %10'unu saklayarak EYFP CENP-A ubiquitylation'ı doğrulayın ve ubikitileted EYFP CENP-A'nın konumunu tam olarak belirleyin. Kütle spektrometresi analizi için diğer %90'ı kullanın.
Kütle spektrometresi örneğini ticari olarak mevcut olan %4-12 Bis-Tris protein jelinde çalıştırın. Sonra Coomassie mavi boyama gerçekleştirmek ve kütle spektrometresi analizi için 50-70 kilodalton jel bölge çıkarmak. Küçük parçalar halinde her jel dilim zar ve 0,5 mililitre düşük protein bağlayıcı tüp yerleştirin.
Jel parçalarını 25 milimolar amonyum bikarbonatta %50 asetonitit 100 mikrolitre ile yıkayın. 10-15 dakika girdap onları. Sonra onları aşağı spin ve supernatant atın.
Son yıkamadan sonra, 30 dakika boyunca bir tezgah üst vakum konsantratörü ile jel parçaları kuru. Mikrolitre sıralama sınıf trippsin başına 10 nanogram 10 mikrolitre ekleyin ve jel parçaları beş dakika için rehydrate sağlar. Sonra 25 milimolar amonyum bikarbonat ekleyin, jel parçaları kapsayacak kadar ve bir gecede 37 derece santigrat onları sindirmek için yeterli.
Ertesi gün, temiz bir 0.65 mililitre silikonlu tüp içine sindirilmiş supernatant aktarın ve% 50 asetonitril ve% 5 formik asit çözeltisi ekleyin. 10 dakika boyunca örnek girdap. Sonra aşağı spin ve bir ekstraksiyon tüpü içine supernatant aktarın.
Numuneyi tekrar iki mikrolitreye yoğunlaştırın. Daha sonra %3 asetonitril ve %2 formik asit çözeltisi sekiz mikrolitre ekleyin. 15 dakika girdap ve 30 dakika boyunca 16,000 kez g aşağı spin.
Kütle spektrometresi aleti ile birleşen sıvı kromatografi sistemi kullanarak LC-MS/MS ile MS veri toplama gerçekleştirin. Numunenin sekiz mikrolitresini ters faz sıvı kromatografi sütununa enjekte edin ve yazı mevzisi yönergelerini takip eden 60 dakika içinde peptidleri %2-80 degradeli B çözücü ile ayırın. Veriye bağımlı edinme modunu kullanarak kütle spektrometresi verilerini toplayın.
Masaüstünde kütle spektrometresi verilerini analiz etmek için ticari yazılımı açın. Yeni bir arama başlatmak için üst menüdeki LC düğmesini tıklatın. Ardından orijinal MS ham veri dosyalarını yüklemek için ekle düğmesini tıklatın.
Paragon yönteminde veritabanı arama yöntemi olarak insan protein kimliğini seçin ve orijinal MS ham veri dosyalarını UniProt homo sapiens veritabanına karşı arayın. Sindirim enzimi olarak tripsin'i seçin ve geri kalan parametreleri el yazması talimatlara göre ayarlayın. Sonuç dosya adını girin ve menünün sağındaki kaydet düğmesine tıklayın.
Ardından arama sonuçlarını depolamak için bir klasör seçin ve kaydet düğmesini tıklatın. Aramayı başlatmak için işlem düğmesini tıklatın. Arama sona erdikten sonra, girilen arama adı içeren veriler otomatik olarak seçili klasörde depolanır.
Herhangi bir spesifik peptidIN MS/MS spektrumlarını elde etmek için, arama sonuçlarını f.Then üst menüdeki protein listesindeki proteine tıklayın ve orta menüdeki peptid'e tıklayın. Bu peptidin MS/MS'si menünün alt kısmında görünür. MS/MS spektrumunu dışa aktarmak ve kaydetmek için, spektrumları kopyalayın ve uygun bir dosya biçimine yapıştırın.
Endojen CENP-A kaybını kurtaran EYFP CENP-A yabani tipi veya K124R mutantının gen yapıları retroviral entegrasyon yapıldığında stably ifade edildi. Endojen CENP-A ekspresyonu Cre rekombinazin indüksiyonundan yedi gün sonra saptanmadı. Hem EYFP CENP-A yabani tip hem de K124R protein ekspresyonu ilk endojen CENP-A proteinine benzer düzeyde bulunmuştur.
Hem EYFP CENP-A vahşi tip ve K124R mutantlar endojen CENP-A kalan ifade bozulmasından sonra yedi gün centromere lokalizasyon gösterdi. EYFP CENP-A vahşi tip ve K124R mutant bayraklı etiketli veya etiketsiz CENP-A vahşi türü ve K124R mutant için durumda aksine HJURP ile ubiquitylation ve etkileşim gösterdi. Hücre canlılığı, kalan endojen CENP-A alelinin bozulmasından 14 gün sonra koloni büyüme çıktısı gerçekleştirerek değerlendirildi.
Hem EYFP CENP-A vahşi tip ve K124R mutantlar kurtarılan koloniler benzer sayıda gösterdi 14 gün kalan endojen CENP-A alel bozulmasından sonra. IP kütle spektrometresi, CENP-A eksi F hücrelerinde EYFP CENP-A K124R'da lizin 306'da ubiquitylation saptandı. Bu sonuçlar birlikte, büyük boyutlu protein füzyon orijinal K124R tek mutant fenotip inhibe CENP-A K124R dışında bir lizin de ubiquitylation indükler önerdi.
Bu protokolü denerken, kütle spektrometresi örneklerini çalıştırmak için ticari olarak mevcut olan %4%12 Bis-Tris protein jellerini kullanın. Jel parçaları için yeterli tripsin ekleyin ve tüm enzimler emilir kadar onları rehydrate. Daha düşük molekül ağırlığı etiketleme veya sondalama tekniği aslında ubiquitylation görselleştirmek ve uzaysal zamansal protein ubiquitylation sinyal araştırmak için gereklidir ve tüm organizma düzeylerinde.
