Este método permite identificar a ubiquização da proteína CENP-A marcada pela EYFP. Também pode ser aplicado à proteína CENP-A humana com diferentes testes e outras proteínas. A principal vantagem disso é que ele pode ser usado para identificar locais onipresentes EYFP CENP-A K124R com significado biológico crucial.
Poderia ser estendido para investigar as modificações pós-translacionais de uma ampla gama de proteínas funcionais. Comece preparando proteínaSas a amarradas com anticorpo anti-GFP. Lave 25 microliters de proteína A contas por reação de imunoprecipitação com tampão A1 pelo menos três vezes para remover o etanol.
Em seguida, faça uma solução de contas de 50% com buffer A1. Adicione dois microliters de anticorpo anti-GFP às contas. Em seguida, adicione o buffer A1 a 20 vezes o volume líquido de contas. Realize rotação de ponta a ponta a quatro graus Celsius durante quatro a 18 horas.
A duração ideal para a rotação deve ser determinada empiricamente com base na eficiência da imunoprecipitação. Após a rotação, centrifufique as contas a 100 vezes g por um minuto e remova o supernatante sem saída. Adicione o buffer A1 para fazer uma solução de 50% de contas e use 25 microliters desta solução para cada reação de imunoprecipitação.
Para realizar a imunoprecipitação, as células de lise no buffer A1 através da sônicação e congelam/descongelam. Medir concentrações proteicas e normalizar as quantidades de proteína entre as diferentes amostras de IP. Em seguida, remova 5% da amostra de cada tubo para ser executada na página SDS.
Misture o resto do liseto com 25 microlitadores de proteína A contas ligadas ao anticorpo anti-GFP e realize rotação de ponta a ponta a quatro graus Celsius por quatro a 18 horas. Após a lise de células no buffer A e a realização de imunoprecipitação como descrito anteriormente, mantenha 10% do total de imunoprecipitantes para confirmar a ubiquização EYFP CENP-A e determinar precisamente a posição do CENP-A ubinciado ubiquílico. Use os outros 90% para análise de espectrometria de massa.
Execute a amostra de espectrometria de massa em um gel de proteína Bis-Tris comercialmente disponível de 4-12%. Em seguida, realize a coloração azul Coomassie e extirpar a região de gel de 50-70 kilodalton para análise de espectrometria de massa. Pique cada fatia de gel em pequenos pedaços e coloque-os em um tubo de ligação de baixa proteína de 0,5 mililitro.
Lave as peças de gel com 100 microlitadores de 50% de acetonitrilo em 25 milimônios bicarbonato de amônio. Vórtice por 10-15 minutos. Em seguida, gire-os para baixo e descarte o supernante.
Após a última lavagem, seque as peças de gel com um concentrador de vácuo superior de banco por 30 minutos. Adicione 10 microliters de 10 nanogramas por trippsina de grau de sequenciamento microliter e deixe as peças de gel se reidratar por cinco minutos. Em seguida, adicione 25 milimônios bicarbonato, apenas o suficiente para cobrir as peças de gel e digeri-las a 37 graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, transfira o supernanato digerido para um tubo silício limpo de 0,65 mililitro e adicione 50% de acetonitrila e 5% solução de ácido fórmico. Vórtice a amostra por 10 minutos. Em seguida, gire-o para baixo e transfira o supernante em um tubo de extração.
Concentre a amostra novamente em dois microliters. Em seguida, adicione oito microliters de 3%de acetonitrila e 2% solução de ácido fórmico. Vórtice por 15 minutos e gire-o para baixo a 16.000 vezes g por 30 minutos.
Realize a aquisição de dados de MS com LC-MS/MS utilizando um sistema de cromatografia líquida aliado a um instrumento de espectrometria de massa. Injete oito microliters da amostra em uma coluna de cromatografia líquida de fase inversa e separe os peptídeos com um gradiente de 2-80% de solvente B em 60 minutos após as instruções do manuscrito. Colete dados de espectrometria em massa usando o modo de aquisição dependente de dados.
Abra o software comercial para analisar dados de espectrometria em massa na área de trabalho. Para iniciar uma nova pesquisa, clique no botão LC no menu superior. Em seguida, clique no botão adicionar para carregar os arquivos de dados brutos ms originais.
Selecione o ID de proteína humana no método de paragon como o método de pesquisa de banco de dados e pesquise os arquivos originais de dados brutos do MS contra o banco de dados UniProt homo sapiens. Selecione trippsina como enzima de digestão e defina o resto dos parâmetros de acordo com as instruções do manuscrito. Digite o nome do arquivo de resultados e clique no botão salvar como botão à direita do menu.
Em seguida, selecione uma pasta para armazenar os resultados de pesquisa e clique no botão salvar. Clique no botão de processo para iniciar a pesquisa. Após o término da pesquisa, os dados com o nome de pesquisa inserido serão armazenados automaticamente na pasta selecionada.
Para obter espectros de MS/MS de qualquer peptídeo específico, abra os resultados da pesquisa no software F.Em seguida, clique na proteína na lista de proteínas no menu superior e clique no peptídeo no menu do meio. O MS/MS deste peptídeo aparecerá na parte inferior do menu. Para exportar e salvar o espectro MS/MS, copie o espectro e cole-o em um formato de arquivo adequado.
Construções genéticas do tipo selvagem EYFP CENP-A ou mutante K124R que resgata a perda do CENP-A endógeno foram expressas com facadas quando a integração retroviral foi realizada. A expressão do CENP-A endógeno não foi detectada sete dias após a indução de Cre recombinase. Tanto o tipo selvagem EYFP CENP-A quanto a expressão proteica K124R foram encontrados em um nível semelhante à proteína CENP-A endógena inicial.
Tanto os mutantes EYFP CENP-A quanto os mutantes K124R mostraram localização de centmere aos sete dias após o rompimento da expressão remanescente do CENP-A endógeno. O tipo selvagem EYFP CENP-A e o mutante K124R mostraram ubiquização e interação com HJURP ao contrário do caso para o tipo selvagem CENP-A marcado ou não e o mutante K124R. A viabilidade celular foi avaliada pela realização do ensaio de crescimento da colônia 14 dias após o rompimento do alelo CENP-A endógeno restante.
Tanto os mutantes EYFP CENP-A quanto os mutantes K124R mostraram um número semelhante de colônias resgatadas 14 dias após o rompimento do alelo CENP-A endógeno restante. A espectrometria de massa IP revelou a ubiquização na lysina 306 em EYFP CENP-A K124R em células CENP-A menos F. Todos juntos, esses resultados sugeriram que a fusão de proteínas de grande porte induz a ubiquização em uma linfótipo diferente do K124R no CENP-A que inibe o fenótipo mutante único K124R original.
Ao tentar este protocolo, use os géis de proteína Bis-Tris disponíveis comercialmente 4%12% para executar as amostras de espectrometria de massa. Adicione trippsina adequada às peças de gel e reidrate-as até que todas as enzimas tenham sido absorvidas. A técnica de marcação ou sondagem de menor peso molecular é realmente necessária para visualizar a ubiquização e investigar a sinalização de ubiquização de proteínas temporais espaciais nos níveis e inteiros do organismo.
