Этот метод позволяет определить повсеместность белка CENP-A с тегами EYFP. Он также может быть применен к человеческому белку CENP-A с различными тестами и другими белками. Основным преимуществом этого является то, что он может быть использован для выявления EYFP CENP-A K124R вездесущие сайты с критическим биологическим значением.
Она может быть расширена для изучения пост-трансляционных модификаций широкого спектра функциональных белков. Начните с подготовки белка бисера связаны с анти-GFP антитела. Вымойте 25 микролитров белка А шарики на иммунопреципиентную реакцию с буфером А1 по крайней мере три раза, чтобы удалить этанол.
Затем сделайте 50%-бисерное решение с буфером A1. Добавьте в бисер два микролитров антитела против GFP. Затем добавьте буфер A1 в 20 раз больше объема чистого шарика. Выполните постепенное вращение при четырех градусах по Цельсию в течение четырех-18 часов.
Оптимальная продолжительность вращения должна определяться эмпирически на основе эффективности иммунопреципиентации. После вращения центрифуга бусы 100 раз г в течение одной минуты и удалите несъеверхающий супернатант. Добавьте буфер А1, чтобы сделать 50%-решение бисера и использовать 25 микролитров этого решения для каждой реакции иммунопреципиентации.
Для выполнения иммунопреципиентации, лизировать клетки в буфере A1 через sonication и замораживания / оттепели. Измерьте концентрацию белка и нормализует количество белка среди различных образцов ИС. Затем удалите 5% образца из каждой трубки для запуска на странице SDS.
Смешайте остальную часть лизата с 25 микролитров белка бусинки связаны с анти-GFP антитела и выполнять все-к-конец вращения на четыре градуса по Цельсию в течение четырех до 18 часов. После лизирования клеток в буфере А и выполнения иммунопреципиентации, как описано ранее, сохранить 10% от общего числа иммунопрециентов, чтобы подтвердить EYFP CENP-A повсеместности и точно определить положение вездесущности EYFP CENP-A. Используйте остальные 90% для анализа масс-спектрометрии.
Вы запустите образец масс-спектрометрии в коммерчески доступных 4-12%Bis-Tris белковый гель. Затем выполните Coomassie голубое окрашивание и акциз 50-70 килодальтон гель области для анализа масс-спектрометрии. Нарезать каждый гель ломтиком на мелкие кусочки и поместить их в 0,5 миллилитров низким содержанием белка связывания трубки.
Вымойте кусочки геля 100 микролитров 50%ацетонитрила в 25 миллимолярный бикарбонат аммония. Вихрь их в течение 10-15 минут. Затем спина их вниз и отказаться от супернатанта.
После последней стирки высушите кусочки геля с помощью вакуумного концентратора на скамейке в течение 30 минут. Добавьте 10 микролитров по 10 нанограмм на микролитер секвенирования трипсина и дайте кусочкам геля регидратироваться в течение пяти минут. Затем добавьте 25 миллимолярия бикарбоната, как раз достаточно, чтобы покрыть кусочки геля и переварить их при 37 градусов по Цельсию в одночасье.
На следующий день перенесите переваренный супернатант в чистую силиконовую трубку на 0,65 миллилитра и добавьте 50%ацетонитрил и 5%formic кислотный раствор. Вихрь образца в течение 10 минут. Затем закрути его вниз и перенесите супернатант в извлечения трубки.
Сосредоточьте образец снова на два микролитера. Затем добавьте восемь микролитров 3%ацетонитрила и 2%formic кислотный раствор. Вихрь его в течение 15 минут и спина его вниз на 16000 раз г в течение 30 минут.
Выполняйте сбор данных MS с помощью LC-MS/MS с помощью жидкой хроматографической системы в сочетании с инструментом масс-спектрометрии. Введи восемь микролитров образца в колонку жидкой хроматографии обратной фазы и разделив пептиды с 2-80%-градиентом растворителя В в течение 60 минут, следуя рукописным указаниям. Сбор данных о масс-спектрометрии с использованием режима приобретения, зависящего от данных.
Откройте коммерческое программное обеспечение для анализа данных масс-спектрометрии на рабочем столе. Чтобы начать новый поиск, нажмите кнопку LC в верхнем меню. Затем нажмите кнопку добавления, чтобы загрузить исходные файлы необработанных данных MS.
Выберите идентификатор человеческого белка в методе paragon в качестве метода поиска базы данных и ищите исходные файлы необработанных данных MS в базе данных UniProt homo sapiens. Выберите трипсин в качестве фермента пищеварения и установите остальные параметры в соответствии с рукописными направлениями. Введите имя файла результатов и нажмите кнопку сохранения справа от меню.
Затем выберите папку для хранения результатов поиска и нажмите кнопку сохранения. Нажмите кнопку процесса, чтобы начать поиск. После окончания поиска данные с введенным именем поиска будут автоматически храниться в выбранной папке.
Чтобы получить СПЕКТР MS/MS любого конкретного пептида, откройте результаты поиска в программном обеспечении F.Then нажмите на белок в списке белков в верхнем меню и нажмите на пептид в среднем меню. MS/MS этого пептида появится в нижней части меню. Для экспорта и сохранения спектра MS/MS скопировать спектры и вставить их в подходящий формат файла.
Генные конструкции дикого типа EYFP CENP-A или мутанта K124R, который спасает потерю эндогенного CENP-A, были стабилико выражены при ретровирусной интеграции. Выражение эндогенной CENP-A не было обнаружено через семь дней после индукции Cre рекомбиназы. Было установлено, что и дикий тип EYFP CENP-A, и экспрессия белка K124R находятся на том же уровне, что и первоначальный эндогенный белок CENP-A.
Как EYFP CENP-A дикого типа, так и мутанты K124R показали локализацию центромера через семь дней после нарушения оставшегося выражения эндогенного CENP-A. Дикий тип EYFP CENP-A и мутант K124R показали повсеместность и взаимодействие с HJURP в отличие от случая для помеченного помеченного или нетегированного дикого типа CENP-A и мутанта K124R. Жизнеспособность клеток оценивалась путем проведения анализа нарастание колонии через 14 дней после нарушения оставшегося эндогенного аллеля CENP-A.
Как EYFP CENP-A дикий тип, так и мутанты K124R показали аналогичное количество спасенных колоний через 14 дней после нарушения оставшегося эндогенного аллеля CENP-A. Масс-спектрометрия ИС выявила повсеместность лизина 306 в EYFP CENP-A K124R в клетках CENP-A минус F. Все вместе эти результаты показали, что слияние крупносерийного белка вызывает повсеместное распространение на лизин, кроме K124R в CENP-A, который подавляет оригинальный один мутантный фенотип K124R.
При попытке этого протокола, использовать коммерчески доступные 4%12%Bis-Tris белковые гели для запуска образцов масс-спектрометрии. Добавьте адекватный трипсин к кусочкам геля и регидратировать их до тех пор, пока все ферменты не будут поглощены. Более низкий молекулярный вес пометки или зондирования техники на самом деле требуется для визуализации повсеместности и исследовать пространственные временные повсеместности белка сигнализации на и весь уровень организма.
