Cette méthode permet d’identifier l’ubiquité de la protéine CENP-A taguée EYFP. Il peut également être appliqué sur la protéine CENP-A humaine avec différents tests et autres protéines. Le principal avantage de ceci est qu’il peut être employé pour identifier les emplacements omniprésents d’EYFP CENP-A K124R avec l’importance biologique cruciale.
Il pourrait être étendu pour étudier les modifications post-translationnelles d’un large éventail de protéines fonctionnelles. Commencez par préparer des perles de protéine A liées à des anticorps anti-GFP. Laver 25 microlitres de protéines A perles par réaction d’immunoprécipitation avec tampon A1 au moins trois fois pour enlever l’éthanol.
Ensuite, faire une solution de perles à 50% avec tampon A1. Ajouter deux microlitres d’anticorps anti-GFP aux perles. Ajouter ensuite le tampon A1 à 20 fois le volume net de perles. Effectuez une rotation de bout en bout à quatre degrés Celsius pendant quatre à 18 heures.
La durée optimale de la rotation doit être déterminée empiriquement en fonction de l’efficacité de l’immunoprécipice. Après la rotation, centrifuger les perles à 100 fois g pendant une minute et enlever le surnatant non lié. Ajoutez le tampon A1 pour faire une solution de 50% de perles et utilisez 25 microlitres de cette solution pour chaque réaction d’immunoprécipitation.
Pour effectuer l’immunoprécipitation, lyse cellules dans le tampon A1 par sonication et gel / dégel. Mesurer les concentrations de protéines et normaliser les quantités de protéines parmi les différents échantillons de propriété intellectuelle. Retirez ensuite 5 % de l’échantillon de chaque tube pour l’exécuter dans la page SDS.
Mélanger le reste du lysate avec 25 microlitres de perles de protéine A liées à l’anticorps anti-GFP et effectuer une rotation de bout en bout à quatre degrés Celsius pendant quatre à 18 heures. Après avoir lysé les cellules dans le tampon A et effectué l’immunoprécipitation comme décrit précédemment, garder 10% du total des immunoprécippitants pour confirmer l’ubiquité EYFP CENP-A et de déterminer avec précision la position de l’UBIQUITYLATED EYFP CENP-A. Utilisez l’autre 90% pour l’analyse de spectrométrie de masse.
Exécutez l’échantillon de spectrométrie de masse dans un gel protéique 4-12%Bis-Tris disponible dans le commerce. Effectuez ensuite la coloration bleue Coomassie et excisez la région de gel de 50 à 70 kilodaltons pour l’analyse de spectrométrie de masse. Couper chaque tranche de gel en petits morceaux et les placer dans un tube de liaison à faible teneur en protéines de 0,5 millilitre.
Lavez les morceaux de gel avec 100 microlitres de 50% d’acétyonitrile en bicarbonate d’ammonium millimolaire. Vortex pendant 10-15 minutes. Ensuite, tournez-les vers le bas et jetez le surnatant.
Après le dernier lavage, sécher les morceaux de gel à l’l’œur d’un concentrateur à vide sur le dessus du banc pendant 30 minutes. Ajouter 10 microlitres de 10 nanogrammes par trypsine de qualité séquençage microliter et laisser les morceaux de gel se réhydrater pendant cinq minutes. Ajouter ensuite 25 millimolaires de bicarbonate d’ammonium, juste assez pour couvrir les morceaux de gel et les digérer à 37 degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain, transférez le supernatant digéré dans un tube siliconisé propre de 0,65 millilitre et ajoutez 50% d’acétylonitrile et 5% de solution acide formique. Vortex l’échantillon pendant 10 minutes. Ensuite, tournez-le vers le bas et transférer le supernatant dans un tube d’extraction.
Concentrez l’échantillon à nouveau sur deux microlitres. Ajouter ensuite huit microlitres de 3% d’acétylonitrile et 2% de solution acide formique. Vortex pendant 15 minutes et tourne-le à 16 000 fois g pendant 30 minutes.
Effectuer l’acquisition de données sur la SP avec LC-MS/MS à l’aide d’un système de chromatographie liquide couplé à un instrument de spectrométrie de masse. Injecter huit microlitres de l’échantillon dans une colonne de chromatographie liquide de phase inverse et séparer les peptides avec un gradient de 2 à 80 % du solvant B en 60 minutes suivant les instructions manuscrites. Recueillir des données de spectrométrie de masse à l’aide du mode d’acquisition dépendant des données.
Ouvrez le logiciel commercial pour analyser les données de spectrométrie de masse sur le bureau. Pour démarrer une nouvelle recherche, cliquez sur le bouton LC sur le menu supérieur. Cliquez ensuite sur le bouton ajouter pour télécharger les fichiers de données brutes MS originaux.
Sélectionnez l’ID de protéine humaine dans la méthode parangon comme méthode de recherche de base de données et recherchez les fichiers de données brutes originaux de MS contre la base de données UniProt homo sapiens. Sélectionnez la trypsine comme enzyme de digestion et définissez le reste des paramètres selon les instructions manuscrites. Entrez le nom de fichier des résultats et cliquez sur l’enregistrer comme bouton sur la droite du menu.
Sélectionnez ensuite un dossier pour stocker les résultats de recherche et cliquez sur le bouton enregistrer. Cliquez sur le bouton processus pour démarrer la recherche. Une fois la recherche terminée, les données avec le nom de recherche saisi seront automatiquement stockées dans le dossier sélectionné.
Pour obtenir des spectres MS/MS de tout peptide spécifique, ouvrez les résultats de recherche dans le logiciel F.Then cliquez sur la protéine dans la liste des protéines dans le menu supérieur et cliquez sur le peptide dans le menu du milieu. Le MS/MS de ce peptide apparaîtra en bas du menu. Pour exporter et enregistrer les spectres MS/MS, copiez les spectres et coller à un format de fichier approprié.
Les constructions génétiques d’EYFP CENP-A de type sauvage ou mutant K124R qui sauve la perte de CENP-A endogène ont été habilement exprimées lorsque l’intégration rétrovirale a été effectuée. L’expression du CENP-A endogène n’a pas été détectée sept jours après l’induction de Cre recombinase. Le type sauvage EYFP CENP-A et l’expression des protéines K124R se sont révélés à un niveau similaire à celui de la protéine endogène initiale CENP-A.
Les mutants de type sauvage EYFP CENP-A et K124R ont montré une localisation centromère à sept jours après la perturbation de l’expression restante du CENP-A endogène. Le type sauvage EYFP CENP-A et le mutant K124R ont montré l’ubiquité et l’interaction avec HJURP contrairement au cas pour le type sauvage marqué ou non marqué CENP-A et le mutant K124R. La viabilité cellulaire a été évaluée en effectuant l’essai de croissance de colonie 14 jours après la perturbation de l’allèle endogène restant de CENP-A.
Les mutants de type sauvage EYFP CENP-A et K124R ont montré un nombre similaire de colonies sauvées 14 jours après la perturbation de l’allèle endogène cenp-A restant. La spectrométrie de masse ip a indiqué l’ubiquité à la lysine 306 dans EYFP CENP-A K124R dans les cellules de CENP-A moins F. Tous ensemble, ces résultats ont suggéré que la fusion de la protéine de grande taille induit l’ubiquité à une lysine autre que K124R dans CENP-A qui inhibe le phénotype mutant simple original de K124R.
Lorsque vous essayez ce protocole, utilisez les gels protéiques Bis-Tris disponibles dans le commerce à 4 %12 % pour exécuter les échantillons de spectrométrie de masse. Ajouter une trypsine adéquate aux morceaux de gel et les réhydrater jusqu’à ce que toutes les enzymes aient été absorbées. Une technique d’étiquetage ou d’enquête moléculaire plus faible est en fait nécessaire pour visualiser l’ubiquité et étudier la signalisation de l’ubiquité des protéines temporelles spatiales aux niveaux et à l’ensemble de l’organisme.
