يستخدم هذا البروتوكول ثلاثة أساليب لتحديد ما إذا كان دخان السجائر يؤثر على الحمل البكتيري pseudomonas في الخلايا الظهارية الرئة. يمكن توسيع هذه الطريقة إلى الخلايا البطانية أو صنابير الخلية الأخرى. إعداد استخراج دخان السجائر والعدوى البكتيرية وتحديد مع الحمل البكتيري هي أيضا وصف تفصيلي في هذا الفيديو.
هذا الإجراء من السهل جداً متابعة للمستخدمين الجدد. رسم 10 ملليلتر من المصل خالية من خلية ثقافة المتوسطة في حقنة 60 ملليلتر. نعلق الطرف الضيق من تقليم إلى طرف ماصة ملليلتر واحد إلى فوهة الحقنة، كمحول لعقد السجائر.
إزالة فلتر من السجائر وإرفاق السجائر إلى محول. لا أكثر من 30 دقيقة قبل إجراء البخارة المقايسة السجائر ورسم 40 ملليلتر من الدخان التي تحتوي على الهواء في الحقنة. اخلط الدخان مع الوسط عن طريق هز الحقنة بقوة.
كرر عملية الرسم حتى يتم حرق السيجارة بالكامل ، والتي تتطلب حوالي 11 رسمًا في حوالي سبع دقائق. لإزالة الكائنات الدقيقة والجسيمات غير القابلة للذوبان من الوسط، قم بتصفيتها من خلال فلتر 0.22 ميكرون. ثم، نقل المتوسطة إلى أنبوب معقمة مغلقة.
تلقيح مرق الصويا tryptic أو TSB لوحة أوجر مع سلالة الزائفة المختارة. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. إعداد أنبوب يحتوي على 20 ملليلتر من TSB مع 5٪ الجلسرين كمصدر للكربون.
جمع مسحة من لوحة أوجر وتطعيم TSB. احتضان تعليق pseudomonas في شاكر 37 درجة مئوية في 200 دورة في الدقيقة ، لمدة ساعة واحدة تقريبا ، حتى الكثافة البصرية في 600 نانومتر هو 0.6. بعد زراعة خلايا ظهارية الرئة كما هو موضح في المخطوطة، أضف ملليلتر واحد من 0.25٪ من التربسين إلى الخلايا.
بعد ما يقرب من خمس دقائق، عندما تكون الخلايا قد فصل تماما من الجزء السفلي من لوحة، إضافة 10 ملليلتر من مرتفعات كاملة المتوسطة لتحييد التربسين. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 ملليلتر. ثم، الطرد المركزي الخلايا لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية و 300 مرة G.Remove والتخلص من الفائق.
ثم، إعادة تعليق الخلايا إلى ملليلتر من المرتفعات المتوسطة مع FBS 10٪. Pipette 10 ميكرولترات من تعليق الخلية الظهارية على لوحة جديدة. استخدام عداد خلية تلقائية للحصول على تركيز الخلية.
لوحة خلايا الرئة الظهارية بتركيز 3 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر، في حجم إجمالي قدره ملليلترين من المتوسط في البئر. احتضان لوحات بين عشية وضحاها. عندما تصل الخلايا إلى 80٪ تقريبًا، استبدل الوسيط بـ Heights medium، بالإضافة إلى 1٪ FBS.
ثم، إضافة 4٪ CSE إلى الآبار واحتضان لوحات لمدة ثلاث ساعات. أضف pseudomonas إلى كل بئر من الخلايا الظهارية المعالجة بالرئتين المعالجة CSE. ثم، احتضان لوحات لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد ذلك، استبدل المتوسط في ألواح الآبار الستة بمليلترين من مرتفعات جديدة متوسطة، تحتوي على 4٪ CSE و100 ميكروغرام لكل ملليلتر من النبلاء. بعد احتضان اللوحات لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون، وpirate المتوسطة من الآبار. غسل الخلايا المعالجة gentamycin، مرتين، مع ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني الباردة.
ويمكن بعد ذلك تحميل البكتيريا في خلايا الرئة الظهارية يمكن الكشف عن طريق طريقة لوحة قطرة، qRT-PCR، أو تدفق عملية استئصال الخلايا. إضافة ملليلتر واحد من خلية تحلل العازلة إلى كل بئر من خلايا الرئة الظهارية. إصلاح التخفيفات التسلسلية من الخلية lysate، تتراوح بين واحد إلى 10 إلى واحد إلى 10،000.
ثم تلقيح لوحة TSB أوجر. بعد 16 ساعة من الحضانة، تحديد عدد وحدات تشكيل مستعمرة كانت موجودة في خلايا الرئة الظهارية، من خلال عد عدد المستعمرات البكتيرية. إضافة 0.35 ملليلتر من العازلة التحلل تحلل guanidinium إلى كل بئر من خلايا الرئة الظهارية.
جمع الخلايا مع مكشطة الخلية. الماصات في lysate في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير وخلط بلطف مع ماصة. إضافة 0.35 ملليلتر من إعداد طازجة إلى 70٪ الإيثانول إلى lysate وخلط جيدا.
نقل كافة العينات إلى عمود دوران وضعت في أنبوب جمع ميليلتر اثنين. الطرد المركزي أنبوب جمع لمدة 30 ثانية في 10، 000 مرة G و 20 إلى 25 درجة مئوية. تجاهل المخزن المؤقت في أنبوب التجميع وغسل العمود مع 0.7 ملليلتر من مخزن الغسيل.
الطرد المركزي العمود في 10، 000 مرة G لمدة 30 ثانية. اغسل العمود مرتين بـ 0.5 ملليلتر من المخزن المؤقت. كرر الطرد المركزي في 10، 000 مرة G لمدة دقيقتين.
ضع العمود في أنبوب جمع جديد 1.5 ملليلتر وأضف 30 إلى 50 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase. بعد الطرد المركزي للأنبوب في 10، 000 مرات G لمدة دقيقة واحدة، وجمع تدفق من خلال وقياس تركيز الجيش الملكي النيبالي. للتحضير ل20 ميكرولتر عكس رد فعل النسخ يجعل ميكروغرام واحد من مجموع الجيش الملكي النيبالي مع 10 ميكرولترات من العازلة رد فعل، ميكرولتر واحد من النسخ العكسي والمياه الخالية من RNase.
إجراء رد فعل النسخ العكسي في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ثم في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. ثم مزيج ميكرولتر واحد من كل عينة cDNA مع خمسة ميكرولترات من المزيج الرئيسي الذي يحتوي على صبغة الإنترنت وميكر واحد من كل 200 ناومورر التمهيدي محددة. إضافة الماء لحجم إجمالي قدره 20 ميكرولترات.
إجراء تحليل PCR، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. ثم استخدم طريقة CT المقارنة لتحديد التعبير. في خلايا BEAS-2B، لم تتغير القدرة على البقاء بشكل كبير عندما تم التعامل مع الخلايا بنسبة 4٪ CSE لمدة ثلاث ساعات.
ساعة واحدة كما عدوى pseudomonas أيضا لم تؤثر بشكل كبير على القدرة على البقاء. وأخيرا ، فإنها تستخدم من gentamycin لقتل pseudomonas في الوسط الثقافة لم يكن لها تأثير يعتد به إحصائيا على بقاء الخلية. كما تقاس طريقة لوحة قطرة، والعدوى البكتيرية في خلايا BEAS-2B زيادة كبيرة عن طريق العلاج مع CSE.
وينطبق الشيء نفسه على علاج CSE من HSAEC. كما تم تقييم العدوى البكتيرية للخلايا المعالجة بيوس-2B المعالجة بـ CSE باستخدام RT-PCR لتحديد كمية 16S rRNA الحالية ، مما يشير إلى زيادة في Pseudomonas aeruginosa. تم تحليل خلايا BEAS-2B المعالجة بـ CSE والمصابة بفلورينسينس Pseudomonas Migula عن طريق قياس التدفق في 509 نانومتر.
وأشارت النتيجة أيضا إلى أن العلاج CSE يزيد من العدوى البكتيرية. أظهرت النتائج من المجهر الفلوري أن البكتيريا التي تحمل علامة GFP تشارك في ترجمة خلايا BEAS-2B في تجربة عدوى الفلوريسينسيسين في Pseudomonas. يمكن أن تتعرض الخلايا لدخان السجائر مع الروبوتات التدخين، والتي قد تحاكي السلوك البشري وتجعل من الممكن دراسة مباشرة آثار دخان السجائر على الخلايا الظهارية الرئة.
يمكن استخدام هذه التقنية لاستكشاف دخان السجائر على صنابير الخلايا الأخرى في سياق عدوى رئوية. النهج الموصوف ليكون الأساس لوضعية العلاجات الفعالة ضد إصابة الرئة الظهرية تدخين السجائر و C0PD إضافية
