باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن زراعة شرائح أنسجة البطين الأيسر البشري خارج الجسم الحي في غرفة محاكاة حيوية. تطبيق الأحمال المسبقة واللاحقة يحسن تشابه البيئة الفسيولوجية. تسمح هذه التقنية بالتسجيل المستمر لتقلص الأنسجة.
تسمح بروتوكولات التحفيز المعرفة من قبل المستخدم بتقييم معلمات الانكماش الحيوية مثل تقوية ما بعد التوقف المؤقت ، وعتبة التحفيز ، وعلاقة تردد القوة ، وفترة الحراريات. إن زراعة شرائح عضلة القلب على المدى الطويل ، باستخدام هذا الإعداد ، ستمهد الطريق للأبحاث المستقبلية خارج الجسم الحي ، مما يسهل هذا الفحص للتأثيرات الدوائية العلاجية والسامة للقلب في طب القلب والأوعية الدموية. للبدء ، قم بغمر غرف الزراعة وأقطاب الجرافيت في لتر واحد من محلول الأيزوبروبانول بنسبة 10٪ وقم بتحريكها بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي ، انقل الغرف إلى محلول أيزوبروبانول 100٪ لمدة 3 دقائق ، ثم اسمح للغرف وأقطاب الجرافيت بالجفاف في الهواء تحت غطاء تدفق صفائحي. قم بإرفاق لوحة دوائر كهربائية بكل غرفة وفقا للمواضع المتاحة على الروك . ضع قطبين كهربائيين من الجرافيت على لوحة الدوائر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، ثم ضع غطاء طبق بتري بقطر 35 ملم على الغرفة لمنع العدوى.
بعد ذلك ، املأ درج القطع بنسبة تصل إلى 90 إلى 95٪ باستخدام مخزن مؤقت للتقطيع. انقل عينة الأنسجة إلى طبق بتري بقطر 100 ملم مملوء بمخزن مؤقت للتقطيع البارد ، وضع الطبق على طبق تبريد عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة ترابيكول الشغاف عن طريق الإمساك بالشغاف باستخدام ملاقط ، ثم استخدم المقص لقطع ما يقرب من 3 ملليمترات من أنسجة الشغاف.
قم بتثبيت عينة الأنسجة المقطوعة ، جانب الشغاف حتى رقعة مطاطية 2 × 2 سم باستخدام أربع إبر قياس 20 × 70 مم بقياس 20 × 70 مم مثبتة في وضع مربع. تأكد من أن الحافة القطرية لكل طرف إبرة تشير إلى الداخل ، مما يعزز التثبيت ويمنع تلف عضلة القلب. باستخدام مشرط ، اقطع جميع الأنسجة الزائدة خارج مربعات الإبرة الأربعة.
باستخدام الملقط ، ضع العينة المشذبة على قطعة معقمة من الأنسجة لمدة 10 ثوان لإزالة المخزن المؤقت الزائد للتقطيع. بعد ذلك ، قم بإزالة حقنة الأغاروز من الحمام المائي وغمر العينة في الأغاروز. دع الأغاروز يتصلب لمدة خمس دقائق على طبق تبريد.
يجب أن يكون الجانب الشغافي من العينة مرئيا في الأغارو. باستخدام الملقط ، ضع الجانب الفوقي من العينة الموجودة في الأغاروز فوق المنطقة الملصقة ، ثم اضغط برفق على العينة المحتوية على الأغاروز من الأعلى باستخدام أداة حادة دون قطع أو إتلاف الأغاروز. دع الغراء يتصلب لمدة 1 دقيقة.
اضبط سعة الاهتزاز على 1 ملليمتر، وسرعة القطع الأولية على 0.07 ملليمتر في الثانية، وسمك الشريحة على 300 ميكرون. بعد توصيل نظام الزراعة بجهاز كمبيوتر ، ابدأ تشغيل البرنامج المقابل. اضبط سرعة الروك على 60 دورة في الدقيقة واضبط معلمات التحفيز مسبقا.
بالنسبة لشرائح القلب البشرية ، اضبط التحفيز القياسي على نبضات ثنائية الطور ذات 50 مللي أمبير أو تيار يتكون من تيار إيجابي 3 مللي ثانية ، وتوقف مؤقت لمدة 1 مللي ثانية ، ونبضة 3 مللي ثانية من التيار المقلوب بمعدل سرعة 30 نبضة في الدقيقة أو نبضة في الدقيقة ، ثم تحقق من مؤشرات القطب الكهربائي للبرنامج وتحقق من أن أقطاب غرف الزراعة تعمل بشكل صحيح. باستخدام ملاقط ، افصل الأغاروز عن الأنسجة. تجنب لمس الأنسجة والتعامل معها بعناية لأن أي ضرر يلحق بالأنسجة سيقلل من معدل نجاح الزراعة.
لإرفاق مثلثين بلاستيكيين بعينة ، ضع 1 ميكرولتر من الغراء على غطاء طبق بتري معقم. استخدم ملاقط مدمن مخدرات لالتقاط مثلث بلاستيكي معقم واحد. اغمس الحافة الأمامية للمثلث بسرعة في الغراء والصق المثلث على العينة عموديا على محاذاة الخلايا العضلية القلبية.
كرر ذلك للمثلث الآخر. باستخدام مشرط، قم بقص الأنسجة التي تتجاوز عرض المثلث وضع الشريحة مع المثلثين المثبتين مرة أخرى في درج القطع الذي يحتوي على مخزن مؤقت للتقطيع. قم بإزالة غرفة الزراعة متوسطة الملء من الحاضنة.
حدد شريحة واحدة معدة وأدخلها في الحجرة عن طريق توصيل مثلث واحد بكل دبوس. اضبط المسافة بين دبابيس التركيب حسب حجم العينة. تأكد من غمر العينة في الوسط.
بعد وضع الطبق على الروك ، قلل التحميل المسبق عن طريق تدوير برغي الضبط عكس اتجاه عقارب الساعة حتى لا يتغير خط الأساس للرسم البياني المقابل على شاشة الكمبيوتر بعد الآن ، ثم قم بزيادة التحميل المسبق أو التوتر بعناية عن طريق تدوير برغي الضبط في اتجاه عقارب الساعة. بالنسبة للغرف ذات الصلابة العالية ، استمر حتى زاد خط الأساس المقابل في الرسم البياني بمقدار 1000 إلى 1200 وحدة تتوافق مع حمولة مسبقة واحدة بالمللي نيوتن. بعد تحضير وسط الزراعة الطازج ، قم بتسخين الوسط مسبقا في حمام مائي أو حاضنة هواء ساخن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 45 دقيقة.
قم بإزالة الوسط من الغرفة ، مع ترك ما يقرب من 0.8 ملليلتر في الغرفة ، ثم أضف 1.6 ملليلتر من الوسط الطازج إلى نفس الغرفة ، مما يجعل الحجم الإجمالي متوسطا إلى 2.4 ملليلتر لكل غرفة. أخيرا ، ضع غطاء الغرفة مرة أخرى وضع غرفة الزراعة في موضعها الخاص. تألفت قراءة تقلص خمس شرائح عضلة القلب أثناء التحفيز النموذجي من أربعة أقسام متميزة من تقوية ما بعد التوقف ، وعتبة التحفيز ، وعلاقة تردد القوة ، وفترة الحرارية.
بالمقارنة مع السيطرة ، انخفضت قوة انكماش الشرائح المعالجة بمضادات الكالسيوم ، نيفيديبين وكالسيسيبتين ، في غضون 10 دقائق. في المقابل ، زاد ناهض قناة الكالسيوم ذو بوابات الجهد ، Bay-K8644 ، من قوة الانكماش. تم تقييم تقوية ما بعد التوقف المؤقت للشرائح الضابطة والمعالجة لإطلاق الكالسيوم داخل الخلايا من الشبكة الساركوبلازمية.
لم تظهر شريحة التحكم أية تغييرات. في وجود الكالسيزيبتين والنيفيديبين ، أدى تثبيط قنوات الكالسيوم من النوع L إلى تقوية الانقباض الأول بعد توقف لمدة 50 ثانية ، مما يعكس مساهمة نسبية أعلى لإطلاق الكالسيوم داخل الخلايا في الانقباض الكلي. لوحظ التأثير المعاكس مع Bay-K8644 ، الذي يحفز دخول الكالسيوم خارج الخلية عبر قنوات الكالسيوم من النوع L.
في تحليل العلاقة بين القوة والتردد ، لم يلاحظ أي تغيير في شريحة التحكم. لم يغير علاج الكالسيزيبتين من قدرة الشريحة على اتباع المحفزات عند زيادة وتيرة التحفيز عند مقارنة بيانات ما قبل المعالجة وبعدها. بالمقارنة مع الكالسيسيبتين ، منع النيفيديبين زيادة في الانقباض بمعدلات سرعة أعلى وخفض الحد الأقصى لمعدل الالتقاط عند 80 نبضة في الدقيقة.
مع Bay-K8644 ، لوحظت زيادة في قوة الانكماش عند ترددات تحفيز منخفضة للغاية. ومع ذلك ، عند الترددات الأعلى من 50 نبضة في الدقيقة ، كانت قوة الانكماش أقل مما كانت عليه أثناء حالة ما قبل المعالجة. يجب نقل الأنسجة المستأصلة بسرعة إلى 4 درجات من شلل القلب.
بعد التقطيع ، يجب إرفاق المثلثات البلاستيكية عموديا على اتجاه الألياف. يجب ألا يتجاوز التحميل المسبق 1500 مللي نيوتن. يمكن أن تساعد زراعة شرائح المحاكاة الحيوية الباحثين على استخدام التلاعب الجيني بالإضافة إلى العلاجات القائمة على الخلايا لدراسة التجديد والإصلاح في عضلة القلب البشرية البالغة.
