Bu prosedür, sivrisinek araştırmacılarının sivrisineklerinin üreme zindeliklerini bireysel düzeyde kolayca ele almalarına izin verir. Geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu protokol sivrisineklerin doğurganlık ve doğurganlığını bireysel düzeyde test etmek için gereken zamanı, alanı ve emeği önemli ölçüde azaltır. Yumurtlama deneyi için plakalar hazırlayarak başlayın.
1,6 milimetrelik bir ev matkabı kullanarak 24 kuyulu bir kültür plakasının kapağında kuyu başına dört ila altı delik açın. Deneyden bir gün önce, plakaları yıkayın ve durulayın ve oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika boyunca% 1 ila% 5 çamaşır suyuna batırın. Daha sonra, plakaları akan deiyonize suyun altında iyice durulayın ve kurulayın.
İyonize suda% 2 agarose eritin ve hemen 24 kuyulu bir plakanın her kuyusuna erimiş agarosenun 500 mikrolitresini ekleyin. Herhangi bir yoğuşma kuruması için plakaları gece boyunca laboratuvar tezgahında bırakın. Kan beslemeden en az 16 saat önce, dişi sivrisineklerden herhangi bir su veya şeker kaynağını çıkarın.
Beslenme gününde, bir su sirkülatörunu 37 santigrat dereceye ısıtın ve sivrisinekleri yapay besleyicilere yerleştirilen omurgalı kanıyla 15 ila 30 dakika besleyin. Daha sonra, sivrisinekleri buz üzerinde bir cam yemeğe aktarın. Kanla kaplanmış olanları seçin ve% 30 sakkaroz suyu içeren bir kaba yerleştirin.
Dişilerin atılım ve yumurta gelişimini bitirmesi için en az 72 saat izin verin. Sivrisinekleri 24 kuyu plakasına aktarmadan yaklaşık bir saat önce, her kuyuya iki ila üç damla su eklemek için bir transfer pipet kullanın. Sivrisinekleri karbondioksitle devirin ve buz üzerinde bir cam tabağa aktarın.
Daha sonra, her bir sivrisineği 24 kuyu plakasının ters bir kapağına ayrı ayrı yerleştirin. 24 sivrisinek de yerleştirildikten sonra, kapağı ters bir plaka tabanıyla örtün, taze yeni bir lastik bantla sabitleyin ve sivrisinekler iyileşene kadar bir çevre odasına yerleştirin. Ardından, plakayı sağ tarafa çevirin.
Dişi sivrisineklerin 24 ila 48 saat boyunca ovipoz yapmasına izin verin. Daha sonra, dişileri plakalardan büyük bir kafese bırakarak çıkarın. Yumurtaları saymadan önce, her kuyuyu kuyu duvarlarında ve fotoğraflarda çözülmesi zor olan agarose ve plastik yüzeyin kenar boşluğunda bulunan yumurtalar için kontrol edin.
Bu yumurtaları düz yüzeye taşımak için ıslak bir boya fırçası kullanın, böylece tüm yumurtalar düzgün bir düzlemdedir ve birbirleriyle örtüşmez. Görüntüleme yumurtalarını etkileyebilecek kuyulardaki kırık bacakları, kanatları ve diğer parçacıkları çıkarmak için forseps kullanın. Mikroskop modunda, kullanıcının bir santimetreye yakın nesnelere odaklanmasını ve her kuyunun görüntüsünü almasını sağlayan kompakt bir dijital kamera ayarlayın.
Bir tabağın her kuyusunun fotoğrafını çektikten sonra, tüm plakanın bir görüntüsünü alın. Her plakayı daha sonra ayırt etmek için bir görüntüleme sırası etiketi kullanın. Agarose fişinin ve yumurtaların kurumasını önlemek ve embriyo gelişimini ve kuluçkalanmasını teşvik etmek için her kuyuya yaklaşık beş damla su ekleyin.
Görüntüleri bir bilgisayara aktarın ve daha kolay organizasyon için dosyaları plaka ve kuyu kimlikleriyle yeniden adlandırın. Görüntüleri ImageJ ile açın ve yumurta kümelerini saymak için yakınlaştırarak veya uzaklaştırarak her yumurtayı işaretlemek için Çok Noktalı Aracı kullanın. Tüm yumurtaları işaretledikten sonra, işaret sayısını getirmek ve sonuçları bir elektronik tabloya kaydetmek için Çok Nokta simgesini çift tıklatın.
Yumurtadan çıkmış larvaları içeren kuyulara ortaya çıkar çıkmaz yiyecek eklemeye başlayın. Yaklaşık beş ila sekiz gün sonra, plakayı 15 ila 20 dakika boyunca ezilmiş buzla kaplayarak larvaları uyuşturun. Kontrastı arttırmak ve plakaları buzda tutarken her kuyunun görüntülerini çekmek için plakanın altına siyah bir malzeme yerleştirin.
Her kuyuyu fotoğraflandıktan sonra, görüntüleme sırası etiketiyle tüm plakanın bir görüntüsünü alın. ImageJ ile görüntüleri açın ve larvaları saymak için Çok Noktalı Aracı kullanın. Larvalar şekil, açı ve odak olarak değişebilir.
Biraz vücuda sahip sadece kafaya benzeyen döken kütikülleri veya küçülmüş larvaları hariç tutun. Sonuçları elektronik tabloya kaydedin. Sivrisineklere, aday demir taşıyıcı, FeT veya bir kontrol geni olan EGFP'yi hedef alan çift iplikli RNA enjekte edildi.
Daha sonra kartal plakası yöntemi kullanılarak kanla beslenerek doğurganlık ve doğurganlık çıkışı ölçüldü. Demir taşıyıcı ifadesinin susturulduğı sivrisinekler hem yumurta sayısında hem de kuluçka oranında önemli bir azalma gösterdi. FeT susturuculu sivrisinekler de gecikmiş atılım ve küçük ve açık renkli yumurtalar sergiledi.
İyi fotoğraflar çekmek bu yöntem için kritik bir adımdır, çünkü resimlerin kalitesi ve bireysel yumurta veya larva miktarı sonuçların kalitesini doğrudan etkiler.
