この手順は、蚊の研究者が簡単に個々のレベルで蚊の生殖フィットネスに対処することができます。従来の方法と比較して、このプロトコルは、蚊の胎児性と生殖能力を個々のレベルでテストするために必要な時間、スペース、労力を大幅に削減します。まず、卵子実験用のプレートを準備します。
1.6ミリメートルの家庭用ドリルを使用して、24ウェル培養プレートの蓋に井戸あたり4〜6穴をドリルします。実験の1日前に、プレートを洗って洗い流し、室温で30〜60分間1%〜5%漂白剤に浸します。その後、脱イオン水を流してプレートを十分に洗い流し、乾燥させます。
脱イオン水で2%アガロースを溶かし、すぐに24ウェルプレートの各ウェルに溶融アガロースの500マイクロリットルを追加します。凝縮を乾かすために、一晩ラボベンチにプレートを置いたままにしておきます。血液を摂食する少なくとも16時間前に、雌の蚊から水または砂糖の任意の供給源を取り除く。
給餌の日には、サーキュレータを摂氏37度に加熱し、人工フィーダーに入れた脊椎動物の血液で蚊に15〜30分間餌を与えます。その後、蚊を氷の上のガラス皿に移します。血液を含むものを選択し、30%スクロース水で容器に入れます。
女性が排泄と卵の発達を終えるのに少なくとも72時間かかります。蚊を24ウェルプレートに移す約1時間前に、移管ピペットを使用して各井戸に2〜3滴の水を加えます。二酸化炭素で蚊を倒し、氷の上のガラス皿に移します。
その後、各蚊を24ウェルプレートの逆蓋に個別に置きます。24個の蚊がすべて入れられたら、蓋を反転プレート底で覆い、新鮮な新しいゴムバンドで固定し、蚊が回復するまで環境室に置きます。その後、プレートを右に上に回します。
メスの蚊に24~48時間のオビポジットを許可します。次に、メスをプレートから大きなケージに取り出して取り除きます。卵を数える前に、井戸の壁やアガロースとプラスチック表面の余白にある卵を十分にチェックしてください。
すべての卵が均一な平面にあり、互いに重ならないように、濡れた絵筆を使用して平らな表面にこれらの卵を移動させます。鉗子を使用して、卵のイメージングを妨げる可能性のある井戸の壊れた脚、翼、および他の粒子を除去します。顕微鏡モードでコンパクトなデジタルカメラを設定すると、1センチメートル近くの物体に焦点を当て、各井戸の画像を撮ることができます。
プレートの各ウェルを撮影した後、プレート全体の画像を撮ります。後で各プレートを区別するために、イメージング順序ラベルを使用します。アガロースプラグと卵が乾燥するのを防ぎ、胚の発達と孵化を誘発するために、各井戸に約5滴の水を加えます。
コンピュータに画像を転送し、簡単に編成するためにプレートと井戸IDでファイルの名前を変更します。ImageJ で画像を開き、マルチポイント ツールを使用して各卵をマークし、ズームインまたはズームアウトして卵の束を数えます。すべての卵をマークした後、マルチポイントアイコンをダブルクリックしてマークの数を表示し、結果をスプレッドシートに記録します。
孵化した幼虫が入った井戸に食べ物を加え始めます。約5~8日後、砕いた氷でプレートを15~20分間覆い、幼虫を麻酔します。プレートの下に黒い材料を挿入してコントラストを高め、プレートを氷の上に置いたまま、各ウェルの画像を撮影します。
各ウェルを撮影した後、画像化順ラベルでプレート全体の画像を撮ります。ImageJ で画像を開き、マルチポイント ツールを使用して幼虫を数えます。幼虫は、形状、角度、焦点が異なる場合があります。
少しの体を持つ頭のみの幼虫のように見える小屋のキューティークル、または縮んだ幼虫を除外します。結果をスプレッドシートに記録します。蚊は、候補鉄輸送体、FeT、または対照遺伝子であるEGFPを標的とする二本鎖RNAを注射した。
その後、彼らは血液供給され、イーグルプレート法を使用して胎児性および生殖能力出力のために測定された。鉄輸送体の発現が沈黙した蚊は、卵数と孵化率の両方で有意な減少を示した。FeTで沈黙した蚊はまた、遅延排泄と小さくて明るい色の卵を示しました。
個々の卵や幼虫の写真や量の質が結果の質に直接影響を与えるので、良い写真を撮ることは、この方法のための重要なステップです。
