يوضح هذا البروتوكول القياسات القياسية ، التي تعكس اللياقة البدنية ، في بعوض الزاعجة المصرية ، وقد تم اختيار معلمات اللياقة هذه لأنها تعكس النجاح التناسلي ، وسهلة القياس ، ويتم الإبلاغ عنها بشكل شائع في الأدبيات. للبدء ، ضع أوراق البيض في ماء معقم طوال الليل في القطاع الداخلي لفقس البعوض المعدل وراثيا والبرية. اسمح لليرقات بإطعام ad libitum من خلال توفير عدة قطرات من ملاط طعام الأسماك المطحونة.
للتأكد من أن البالغين عذارى ، افصل الشرانق حسب الجنس بمجرد ظهورها ، وانقل الخادرة إلى شريحة مجهر زجاجية وقم بإزالة الماء الزائد بالأنسجة لشل حركة الخادرة. تحت مجسمة في التكبير مرتين إلى أربع مرات ، باستخدام فرشاة رسم ذات رأس دقيق ، ضع الخادرة ووجهها لأعلى. ثم تحليل بصريا الذيل للاختلافات في شكل الفص التناسلي.
ضع الشرانق من الذكور والإناث في أكواب ماء منفصلة في الاحتواء المناسب. لعبور النوع البري أو الجين المعدل وراثيا ، يدفع واحد أو جين اثنين من الذكور على كتلة مع إناث من النوع البري البكر ، أضف البعوض المخدر بنسب خمسة ذكور إلى أنثى واحدة في علب البعوض التي تحتوي على ما يقرب من 150 بعوضة. بعد يومين إلى ثلاثة أيام ، قم بتوفير مصدر دم على القفص لإطعام الإناث باتباع ممارسات التربية القياسية.
قم بفرز الإناث التي تتغذى على الدم من الإناث غير المغذية عن طريق فحص بطونهن بصريا بحثا عن الاحتقان والتخلص من غير المتغذية جزئيا والتغذية والذكور. ضع الإناث المحتقنات مرة أخرى في أقفاصها. بعد يومين إلى ثلاثة أيام ، ضع الإناث الفردية في أنابيب مخروطية سعة 50 ملليلتر مبطنة بورق ترشيح مكتوب عليه مسبقا بقلم رصاص.
املأ جميع الأنابيب بخمسة ملليلتر من ماء الصنبور. ضع قطعة صغيرة من الزبيب أو كرة قطنية مبللة بالسكر على كل أنبوب مخروطي. اترك الإناث في القطاع لمدة يوم إلى يومين واسمح لها بالبيض.
ثم عد عدد البيض على كل ورقة واحسب متوسط الخصوبة ، حيث أن عدد البيض المحسوب على كل ورقة مقسوما على عدد الإناث التي تم فحصها. لتجفيف أوراق البيض ، قم بتصريف المياه من الأنابيب ووضعها مرة أخرى في القطاع. لتجميد الإناث اللواتي يتغذين على الدم من دراسة الخصوبة المكتملة ، ضع أقفاص البعوض عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 15 دقيقة تقريبا.
تشريح الجناح الأيسر لكل بعوضة ، واستئصال مفصل الجناح والصدر وإزالة الجناح بأكمله. باستخدام الملقط ، ضع الجناح بشكل مسطح على شريحة زجاجية ، ثم أضف قطرة واحدة من محلول المخزون 15 ملليلتر الذي يتكون من 70٪ إيثانول وقطرة واحدة من صابون الأطباق إلى الجناح على الشريحة باستخدام ماصة النقل. بعد ذلك ، أضف قطرة واحدة من 80٪ من الجلسرين إلى قسيمة الغطاء وضعها أعلى الجناح في محلول صابون الإيثانول.
قم بتصوير الأجنحة المثبتة على الشرائح باستخدام كاميرا بعدسة 65 ملم. استخدم برنامج TpsDig لتحديد الإحداثيات الديكارتية ثنائية الأبعاد للمعالم. احسب طول الجناح ومساحته باستخدام نص R الموجود في المخطوطة.
احسب حجم السنترويد للجناح ، وهو مقياس للحجم ، مستقل إحصائيا عن الشكل المعرف على أنه الجذر التربيعي لمجموع المسافات المربعة لكل معلم من النقطة المركزية للجناح يفقس بيض F1 الفردي من الأوراق التي تم جمعها من الإناث المفردة في حاويات ديلي شفافة من مادة البولي بروبيلين تحتوي على 100 ملليلتر من الماء منزوع الأيونات المعقم حديثا. في يومين إلى ثلاثة أيام بعد الفقس ، أخرج أوراق البيض من الماء واتركها تجف طوال الليل. أعد تفريخ أوراق البيض في نفس الحاويات التي فقست فيها في البداية.
في ثلاثة إلى خمسة أيام بعد الفقس الأولي ، افحص اليرقات بصريا بحثا عن علامة معدلة وراثيا. سجل عدد اليرقات المعدلة وراثيا الإيجابية أو السلبية. تخلص من اليرقات السلبية.
احسب الخصوبة على أنها عدد اليرقات المعدلة وراثيا أو الضابطة مقسومة على إجمالي عدد البيض. لتحديد نسبة الجنس ، أضف عدد الإناث أو عدد الذكور التي تم جمعها عبر الجدول الزمني للدراسة لكل بعوضة أنثى بالغة. اقسم هذا الرقم على عدد الشرانق التي تم جمعها لنفس خط البعوض الناتج عن أنثى واحدة.
لتحديد صلاحية اليرقات ، أضف العدد الإجمالي للشرانق التي تم جمعها عبر الجدول الزمني للدراسة لكل أنثى بعوضة بالغة. اقسم هذا الرقم على عدد اليرقات التي تم عدها لكل أنثى بعوضة بالغة لنفس الخط الذي تم حسابه سابقا. احسب تطور اليرقات إلى الشرانق كمتوسط الوقت اللازم لتطور الشرانق بعد الفقس.
لتحديد مساهمة الذكور ، اعبر 50 من الذكور المحورين وراثيا أو الضابطين مع 100 أنثى تحكم في كرتون سعة 64 أونصة بحيث يكون هناك 50 ذكرا مع 100 أنثى. بعد التزاوج ، قدم للبعوض وجبة دم ، باتباع ممارسات التربية القياسية. ثم افصل الإناث المحتقنة بالكامل إلى أنابيب مخروطية سعة 50 ملليلتر مبطنة بورق ترشيح أبيض مسمى مسبقا.
اترك الإناث لمدة يوم إلى يومين في القطاع الداخلي واسمح لهن بالبيض. اترك الأوراق تجف في أنابيب في القطاع لمدة خمسة أيام على الأقل. استخدم الملقط لإزالة الأوراق ووضعها للتفريخ.
في يومين إلى ثلاثة أيام بعد الفقس ، أخرج أوراق البيض من الماء واتركها حتى تجف. أعد تفريخ أوراق البيض في نفس الحاويات. في ثلاثة إلى خمسة أيام بعد الفقس الأولي ، افحص اليرقات بصريا بحثا عن علامة معدلة وراثيا.
احسب مساهمة الذكور على أنها عدد اليرقات المعدلة وراثيا F2 مقسوما على عدد اليرقات الكلية لكل خط بعوضة. نقل 50 من الذكور و 50 أنثى من النوع البري أو العمر المعدل وراثيا المطابق للبعوض غير المغذي بالدم إلى حاوية مناسبة. تتبع عدد البعوض النافق من الذكور والإناث كل يوم.
احسب طول العمر كمتوسط عدد الأيام التي مرت قبل موت البعوض عبر الأقفاص ، مع حذف البعوض الذي يموت لأسباب غير إعلامية. تم تقييم اليرقات إلى الشرانق البالغة والشرانق إلى أوقات نمو البالغين باستخدام مقارنات Kruskal-Wallis'ANOVA و Dunn اللاحقة. كان لذكور البعوض من النوع البري وقت أقصر للتشرنق من الإناث من النوع البري ، في حين أن ذكور D7L1 لم تختلف اختلافا كبيرا في وقت الجرعة بالنسبة لإناث D7L1.
استغرقت إناث D7L1 وقتا أطول للوصول إلى الجرو من الإناث من النوع البري ، كما تفعل ذكور D7L1 ، بالنسبة للذكور من النوع البري. فيما يتعلق بالشرانق إلى وقت نمو البالغين ، لم تختلف الإناث من النوع البري والإناث D7L1 بشكل كبير ، حيث أن الذكور من النوع البري أسرع من الإناث من النوع البري وذكور D7L1. لم تصل إناث البعوض البرية إلى متوسط وقت بقائها على قيد الحياة أثناء الدراسة.
وصلت جميع المجموعات الأخرى إلى متوسط بقائها على قيد الحياة قبل 40 يوما ، مع فصل زمني واضح لمتوسط أوقات البقاء على قيد الحياة. كان للبعوض D7L1 بالضربة القاضية مساحة جناح أصغر بكثير من نظرائه من النوع البري ، ولكن لم تكن هناك اختلافات في حجم الجناح أو النقطه الوسطى. لم يكن لدى البعوض الذي يؤوي نسخة واحدة من شريط محرك الجينات تحت تعبير مروجي النانو أو ZPG لياقة مختلفة بشكل كبير مقارنة بخط عين هيغز الواسع ، مع استثناء ملحوظ لصلاحية اليرقة.
يمكن استخدام بيانات اللياقة التي تم جمعها هنا في تطبيقات المصب مثل النمذجة الرياضية. بالنسبة للدراسات التي تقيم استراتيجيات المكافحة الجينية الجديدة ، سيكون من الضروري إجراء دراسات قفص أكبر في ظروف شبه ميدانية بعد دراسات اللياقة البدنية للمهارات الصغيرة الموضحة هنا. تساعد دراسات اللياقة البدنية في المختبر في تحديد الآثار غير المقصودة للضربات القاضية أو الضربات القاضية الجينية.
يمكن أن يؤدي التخلص من البروتين اللعابي إلى إجهاد النمو ، في حين أن محرك الجينات في محرك الجينات واحد واثنين من البعوض أظهر معدلات بقاء أقل لليرقات. أثر قياس لياقة محرك الجينات بشدة على استمراره في محاكاة السكان بعد النمذجة الرياضية.
