Este procedimento permite que os pesquisadores de mosquitos abdorem facilmente a aptidão reprodutiva de seus mosquitos no nível individual. Em comparação com os métodos convencionais, este protocolo reduz significativamente o tempo, o espaço e o trabalho necessários para testar a fecundidade e fertilidade dos mosquitos no nível individual. Comece preparando placas para o experimento de oviposition.
Faça de quatro a seis furos por poço na tampa de uma placa de cultura de 24 poços usando uma broca doméstica com um bit de 1,6 milímetros. Um dia antes do experimento, lave e enxágue as placas e mergulhe-as em 1%a 5% de alvejante por 30 a 60 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, enxágue as placas completamente sob água deionizada e seque-as.
Derreta 2% de agarose em água deionizada e adicione imediatamente 500 microliters da agarose derretida a cada poço de uma placa de 24 poços. Deixe as placas no banco do laboratório durante a noite para secar qualquer condensação. Pelo menos 16 horas antes da alimentação sanguínea, remova qualquer fonte de água ou açúcar das fêmeas mosquitos.
No dia da alimentação, aqueça um circulador de água a 37 graus Celsius e alimente os mosquitos com sangue de vertebrado colocado em alimentadores artificiais por 15 a 30 minutos. Então, transfira os mosquitos para um prato de vidro no gelo. Selecione os que estão engorgados com sangue e coloque-os em um recipiente com 30% de água de sacarose.
Permita pelo menos 72 horas para que as fêmeas terminem a excreção e o desenvolvimento de óvulos. Cerca de uma hora antes de transferir mosquitos para a placa de 24 poços, use uma pipeta de transferência para adicionar duas a três gotas de água em cada poço. Derrube mosquitos com dióxido de carbono e transfira-os para um prato de vidro no gelo.
Em seguida, coloque individualmente cada mosquito em uma tampa invertida da placa de 24 poços. Uma vez colocados todos os 24 mosquitos, cubra a tampa com um fundo de placa invertido, fixe-o com um novo elástico fresco e coloque-o em uma câmara ambiental até que os mosquitos se recuperem. Em seguida, vire a placa para cima.
Deixe as fêmeas mosquitos oviposit por 24 a 48 horas. Em seguida, remova as fêmeas liberando-as das placas em uma gaiola grande. Antes de contar os ovos, verifique cada poço em busca de ovos que estão nas paredes do poço e à margem da superfície agarose e de plástico onde são difíceis de resolver em fotografias.
Use um pincel molhado para mover esses ovos para a superfície plana para que todos os ovos estejam em um plano uniforme e não se sobreponham uns aos outros. Use fórceps para remover quaisquer pernas, asas e outras partículas quebradas nos poços que possam interferir com ovos de imagem. Defina uma câmera digital compacta no modo microscópio, que permite ao usuário focar em objetos tão próximos quanto um centímetro e tirar uma imagem de cada poço.
Depois de fotografar cada poço de um prato, tire uma imagem de toda a placa. Use um rótulo de ordem de imagem para distinguir cada placa mais tarde. Adicione cerca de cinco gotas de água a cada poço para evitar que seu plugue de garose e os ovos sequem e induzam o desenvolvimento e a eclosão de embriões.
Transfira as imagens para um computador e renomeie os arquivos com a placa e os IDs de poço para uma organização mais fácil. Abra as imagens com ImageJ e use a Ferramenta Multi-ponto para marcar cada ovo, ampliando ou saindo para contar os aglomerados de ovos. Depois de marcar todos os ovos, clique duas vezes no ícone De vários pontos para aumentar o número de marcas e registrar os resultados em uma planilha.
Comece a adicionar alimentos aos poços que contêm larvas eclodidas assim que elas aparecerem. Aproximadamente cinco a oito dias depois, anestesiar as larvas cobrindo a placa com gelo esmagado por 15 a 20 minutos. Insira um material preto sob a placa para melhorar o contraste e tirar imagens de cada poço enquanto mantém as placas no gelo.
Depois de fotografar cada poço, tire uma imagem de toda a placa com um rótulo de pedido de imagem. Abra imagens com ImageJ e use a Ferramenta Multi-ponto para contar as larvas. Larvas podem variar em forma, ângulo e foco.
Exclua as cutículas do galpão, que parecem larvas somente para a cabeça com um pouco de corpo, ou larvas encolhidas. Regissos resultados na planilha. Mosquitos foram injetados com RNA de duplar encalhada visando um transportador de ferro candidato, FeT, ou um gene de controle, EGFP.
Em seguida, foram alimentados com sangue e medidos para fecundidade e produção de fertilidade usando o método da placa águia. Mosquitos em que a expressão do transportador de ferro foi silenciada apresentaram uma redução significativa tanto no número de ovos quanto na taxa de escotilha. Mosquitos silenciados por FeT também apresentaram excreção retardada e ovos pequenos e de cor clara.
Tirar boas fotos é um passo crítico para este método, pois a qualidade das fotos e a quantidade de ovos individuais ou larvas afetam diretamente a qualidade dos resultados.
