24 잘 조직 배양 플레이트를 사용하여 Aedes aegypti에 대한 개선 된 Fecundity 및 불임 분석 (EAgaL 플레이트)

이 절차는 모기 연구원이 개별적인 수준에서 그들의 모기의 생식 적 적합성을 쉽게 해결하는 것을 허용합니다. 기존의 방법에 비해, 이 프로토콜은 개별 수준에서 모기의 fecundity 및 다산을 시험하는 데 필요한 시간, 공간 및 노동력을 크게 감소시킵니다. oviposition 실험을 위한 플레이트를 준비하여 시작합니다.

1.6밀리미터 비트의 가정용 드릴을 사용하여 24웰 배양 판의 뚜껑에 잘 4~6홀을 드릴한다. 실험 하루 전에 접시를 씻고 헹구고 실온에서 30~60분 동안 1%에서 5%의 표백제에 담급니다. 그런 다음, 실행 탈이온 물에서 철저하게 판을 헹구고 건조.

2%아가로즈를 탈온된 물에 녹이고 24웰 플레이트의 각 웰에 용융 아가로즈 500마이크로리터를 즉시 추가합니다. 모든 응축을 건조하기 위해 밤새 실험실 벤치에 접시를 둡니다. 혈액 공급 하기 전에 적어도 16 시간, 여성 모기에서 물 또는 설탕의 어떤 소스를 제거.

먹이주기 당일, 물 순환기를 섭씨 37도로 가열하고 15~30분 동안 인공 피더에 척추혈액을 공급합니다. 그런 다음 모기를 얼음에 유리 접시로 옮기습니다. 혈액으로 가득 채진 사람을 선택하고 30 %의 자당 물이있는 용기에 넣습니다.

암컷이 배설및 계란 발달을 완료하는 데 적어도 72 시간을 허용하십시오. 모기를 24웰 플레이트로 옮기기 약 1시간 전에 이송 파이펫을 사용하여 2~3방울의 물을 각 우물에 넣습니다. 이산화탄소로 모기를 쓰러뜨리고 얼음 위에 있는 유리 접시로 옮겨넣습니다.

그런 다음 각 모기를 24웰 플레이트의 반전 뚜껑에 개별적으로 놓습니다. 24마리의 모기가 모두 배치되면 뚜껑을 뒤집어 놓은 플레이트 바닥으로 덮고 신선한 새로운 고무 밴드로 고정하고 모기가 회복될 때까지 환경 챔버에 놓습니다. 그런 다음 플레이트를 오른쪽으로 돌립니다.

암컷 모기가 24~48시간 동안 배란하도록 허용하십시오. 그런 다음 접시에서 큰 케이지로 방출하여 암컷을 제거합니다. 계란을 계산하기 전에, 그들은 사진에서 해결하기 어려운 아가로즈와 플라스틱 표면의 여백에 있는 잘 각 우물을 확인합니다.

젖은 페인트 브러시를 사용하여 이 달걀을 평평한 표면으로 이동하여 모든 계란이 균일한 평면에 있고 서로 겹치지 않도록 합니다. 집게를 사용하여 화상 진찰 계란을 방해할 수 있는 우물의 부러진 다리, 날개 및 기타 입자를 제거하십시오. 현미경 모드로 컴팩트한 디지털 카메라를 설정하여 사용자가 1센티미터에 가까운 물체에 집중하고 각 웰의 이미지를 볼 수 있습니다.

접시의 각 우물을 촬영 한 후, 전체 접시의 이미지를 가져 가라. 이미징 주문 레이블을 사용하여 나중에 각 플레이트를 구분합니다. 아가로즈 플러그와 알이 건조되는 것을 방지하고 배아 발달및 부화를 유도하기 위해 각 우물에 약 5 방울의 물을 추가합니다.

이미지를 컴퓨터로 전송하고 더 쉬운 조직을 위해 플레이트와 잘 I를 사용하여 파일이름을 바꿉니다. ImageJ로 이미지를 열고 멀티 포인트 도구를 사용하여 각 달걀을 표시하고 확대 또는 밖으로 나와 달걀 덩어리를 계산합니다. 모든 계란을 표시한 후 멀티 포인트 아이콘을 두 번 클릭하여 마크 수를 늘리고 결과를 스프레드시트에 기록합니다.

부화된 애벌레가 들어있는 우물에 음식을 추가하기 시작합니다. 약 5~8일 후, 15~20분 동안 분쇄된 얼음으로 접시를 덮어 애벌레를 마취합니다. 플레이트 아래에 검은 색 소재를 삽입하여 대비를 높이고 각 음의 이미지를 잘 사용하여 접시를 얼음 위에 유지합니다.

각 우물을 촬영한 후 이미징 주문 라벨로 전체 플레이트의 이미지를 촬영합니다. ImageJ로 이미지를 열고 다중 점 도구를 사용하여 애벌레를 계산합니다. 애벌레는 모양, 각도 및 초점이 다를 수 있습니다.

몸의 조금 머리 전용 애벌레처럼 보이는 창고 큐키클을 제외, 또는 수축 애벌레. 결과를 스프레드시트에 기록합니다. 모기는 후보철 수송기, FeT, 또는 대조유전자, EGFP를 표적으로 하는 이중 좌초 RNA로 주입되었다.

그 후, 그들은 혈액을 공급하고 독수리 플레이트 방법을 사용하여 fecundity 및 불임 출력을 측정하였다. 철 수송자 발현이 침묵된 모기는 계란 수와 해치 비율 모두에서 현저한 감소를 나타냈다. 태아침묵 모기는 또한 지연 배설및 작고 밝은 색깔의 계란을 전시했습니다.

개별 계란 이나 애벌레의 사진 및 수량의 품질이 결과의 품질에 직접적인 영향을 미치기 때문에 좋은 사진을 찍는 것은이 방법에 대한 중요한 단계입니다.