نحن نستخدم هذا البروتوكول للبحث عن مرشحين لقاحات جديدة ضد السل، ولكن يمكن تطبيقي على الأمراض المعدية الأخرى. وبالمقارنة مع نماذج الثدييات، توفر هذه الطريقة إجراءً فعالاً من حيث التكلفة للفحص الأولي لمرشحين لقاحات جديدة تعتمد على الحمض النووي. إثبات الإجراء سيكون هانالينا بيببو، فني من مختبرنا.
للبدء، تعيين الشعيرات الدموية الزجاجية في الخامس الأخدود في شريط القطبية وتشديد مقبض لقط طفيفة. نقل حامل بجانب خيوط ودفع بلطف الشعرية من خلال خيوط وإلى شريط القطبية على الجانب الآخر من خيوط. المقبل، وتشديد المقابض لقط، تعيين أسفل الزجاج السلامة، واضغط على زر السحب.
بعد ذلك، ضع الإبر على قطعة لاصقة قابلة لإعادة الاستخدام داخل طبق بيتري لحماية نصائح الإبرة. أولاً، إعداد مزيج الحقن باستخدام 0.5 إلى 12 ميكروغرام من البلازميد لكل جرعة. إعداد الحجم المناسب من المزيج الرئيسي لعدد الأسماك في المجموعة.
ضع الإبرة الشعرية على الجانب اللزجة من قطعة من الشريط على حامل مناسب. المقبل، قطرات ماصة من جرعات البلازميد على قطعة من فيلم المختبر. بعد ذلك، استخدم تلميح التحميل لنقل قطرات البلازميد من الفيلم إلى الإبرة.
الماصات ببطء وبعناية لتجنب فقاعات الهواء الأنابيب في الإبرة. ضع المتلاعب الصغير ومصدر الضوء. ثم قم بتبديل ضغط الهواء إلى الموضع المفتوح.
على اللوحة الأمامية حاقن الصغرى ضبط طول النبض إلى 10 ثانية باستخدام وضع الوقت. ثم، ضبط طول النبضة بدقة باستخدام قرص فترة 10-turn. المقبل، تعيين الإبرة على حامل ماصة صغيرة من المتلاعب الصغرى.
استخدم ملاقط لقطع طرف الإبرة للسماح بدفع السائل للخارج، واستخدم المجهر لتقييم موضع الإبرة. اضغط على مفتاح القدم عن بعد مرة واحدة للتحقق من أن نبضة ثانية واحدة تدفع قطرة صغيرة من الإبرة. ثم ضبط إعدادات electroporator وربط الملاقط إلى electroporator.
للحفاظ على السمك في وضع ثابت أثناء الحقن استخدام قطعة من الاسفنج مع قطع الأخدود في منتصف كما الحشو. نقع الاسفنج جيدا في المياه النظام ووضعها في طبق بيتري. باستخدام ملعقة بلاستيكية، نقل حمار وحشي تخدير إلى الإسفنج الرطب مع الجانب البطني للأسماك أسفل في الأخدود.
تحت المجهر وضع الإبرة في زاوية 45 درجة على مقربة من العضلات الظهرية في سمك الحمار الوحشي، ثم العثور على بقعة صغيرة دون جداول أمام زعنفة الظهر ودفع الإبرة في العضلات. إذا كان يشعر أي مقاومة محاولة بقعة المجاورة. استخدام مفتاح القدم لحقن تدريجيا حل البلازميد في العضلات.
تحت المجهر يجب أن يكون أحمر الفينول مرئيًا عند دخوله إلى الأنسجة العضلية. الكهربائي الأسماك مباشرة بعد الحقن عن طريق وضع أقطاب من نوع المقطط في كل جانب من موقع الحقن. اضغط على زر البدء على electroporator واعطاؤه ست نبضات 40 فولت 50 مللي ثانية.
ثم، نقل بلطف الأسماك إلى خزان الانتعاش. وأخيرا، بعد اصطيد الأسماك وفقا لبروتوكول النص، واستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية لرؤية التعبير EGFP بالقرب من موقع الحقن. في هذا البروتوكول، تم استنساخ مستضدات الحمض النووي المجاورة لGFP في متجه التعبير.
تم حقن سمك الحمار الوحشي مع الحمض النووي المستضد البلازميدات داخل العضل مع حاقن الصغيرة، وكان موقع الحقن الكهربائي لتحسين تناول البلازميدات في الخلايا. للتصوير، يمكن تصور التعبير المستضد مع المجهر الفلوريس. في هذه الحالة، تم الكشف عن التعبير عن جميع البروتينات الانصهار المستضدية 2000 بالقرب من موقع الحقن، على الرغم من أن شدتها تختلف.
بعد خمسة أسابيع من التحصين مع المستضدات الفطرية تم إصابة حمار وحشي مع ماراتينوم الميكوبتريا. وقد استُخدم هذا المرض لتحديد العبء البكتيري في كل سمكة بعد أربعة أسابيع من الإصابة. بالمقارنة مع مجموعة التحكم، وأظهرت الأسماك المحصنة مع مستضد واحد انخفاض الأحمال البكتيرية بعد العدوى مع M.marinum.
أثناء تنفيذ هذا الأسلوب من المهم تصميم بناء البلازميد بعناية، والتحقق من صحة التعبير عن المستضد، وممارسة تقنية الحقن قبل التجارب على نطاق واسع. يمكن لهذه التقنية أن تمهد الطريق لفحص فعال من حيث التكلفة قبل السريرية للمرشحين الرواية للقاحات المستندة إلى الحمض النووي في الحمار الوحشي البالغ. لا ننسى أن رفاهية الحيوانات مهم جدا، والتخدير السليم أمر ضروري أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
