في هذا الفيديو، سوف نبرهن على زراعة العقدة العنقية المتفوقة للفئران الجنينية للتحليل المورفولوجي والبروتيومي. قبل البدء في تشريح، وإعداد وسائل الإعلام السيطرة وتشريح. يحتوي وسيط التحكم F-12 وانخفاض الجلوكوز DMEM مكملة بخليط الأنسولين-السيلينيوم-نقل الرين, الجلوتامين, عامل نمو الأعصاب, وBSA.
تشريح المتوسطة يحتوي على L-15 تكملها مع بكتيريا القلم وBSA. راجع المخطوطة للحصول على بروتوكولات مفصلة لإعداد وسائل الإعلام. إعداد لوحات لعبادة الخلايا العصبية.
تخفيف ملليغرام واحد لكل ملليلتر من مخزون بولي-د-ليسين إلى 100 ميكروغرام لكل ملليلتر مع الماء المقطر العقيم. لتحليل البروتيوم أو الجينوم ، قبل يوم إلى يومين من تشريح ، معطف ستة لوحات بئر مع ما يقرب من مليلتر من 100 غرام معقمة لكل ملليلتر من بولي - د - ليسين. وهذا ضروري لضمان التصاق الخلية إلى البئر.
التفاف لوحات مع فيلم التشبث وتخزين لوحات بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في يوم التشريح ، قبل بدء التشريح ، قم بإزالة محلول بولي دي ليسين من الآبار وشطف الآبار خمس مرات بالماء المقطر العقيم ، يليه مرة واحدة مع DMEM منخفض الجلوكوز. أثناء الهضم الأنزيمي للعصابة، ما يقرب من ساعة قبل طلاء الخلايا، وpirem DMEM من لوحات واستبداله مع 0.3 ملليلتر من متوسطة التحكم.
تخزين لوحات في 35 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 في غرفة مرطبة. في غطاء محرك السيارة، قم بإعداد العناصر التالية للتشريح. أربعة 50 ملليلتر أنابيب مخروطية مع حوالي 20 ملليلتر من وسائل الإعلام تشريح في كل أنبوب.
أربعة أطباق معقمة 35 ملليمتر مع 1.5 ملليلتر من وسائل الإعلام تشريح. واحد معقم 50 ملليلتر أنبوب مخروطي مع 20 ملليلتر من وسائل الإعلام تشريح للطرد المركزي. واحد 15 ملليلتر أنبوب مخروطي معقم للrifuging ganglia، واحد أنبوب 10 ملليلتر العقيمة لجمع الخلايا المتفككة.
استخدام معقمة الخرز الجاف لتعقيم زوج من ملقط غرامة لمدة دقيقة واحدة على الأقل. وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في كلية سانت ماري في كاليفورنيا على جميع الإجراءات التي أجريت في الدراسات التي تشمل الحيوانات. وقد وضعت المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانات واستخدامها في كلية سانت ماري في كاليفورنيا استنادا إلى المبادئ التوجيهية التي قدمها مكتب رعاية الحيوان المختبري في المعاهد الوطنية للصحة.
إزالة الأجنة E21 من الفئران الحامل. لاحظ أن إزالة قرن الرحم يمكن أن تتم خارج غطاء محرك السيارة إذا تم تعقيم المنطقة المحيطة بها بشكل دقيق. القتل الرحيم فأر حامل مع استنشاق CO2.
القص الفراء من منطقة البطن ومسح الجلد في المنطقة مع 70٪ الكحول لتعقيمه. باستخدام مجموعة جديدة من مقص معقمة ملقط، وقطع من خلال الجلد ومن ثم العضلات لفضح قرون الرحم التي تحتوي على الأجنة. إزالة قرن الرحم مع الأجنة، وذلك باستخدام مجموعة جديدة من مقص ملقط، مع الحرص على عدم تلف الأمعاء في هذه العملية.
نقل قرن الرحم مع الأجنة في 150 ملليمتر طبق بيتري عقيمة ونقلها إلى غطاء محرك السيارة. باستخدام مجموعة جديدة من ملقط ومقص، إزالة الأجنة من قرن الرحم وفصل الأجنة من الأغشية السلوية والمشيمة. القتل الرحيم الأجنة، وقطع الحبل الشوكي من الأجنة على طول خط الوسط تحت الذراع اليمنى.
وهذا سوف يقلل من النزيف من الشريان السباتي أثناء إزالة SCG. نقل هذه الأجنة إلى أنابيب مخروطية 50 ملليلتر المعدة التي تحتوي على وسائل الإعلام التشريح. تأكد من أن الأجنة مغمورة في وسائل الإعلام.
يمكن لكل أنبوب أن يحمل ما يصل إلى ثلاثة أجنة. عزل العقدة العنقية متفوقة من الجنين. نقل جرو واحد من وسائل الإعلام تشريح على طبق بيتري 150 ملليمتر عقيمة نصف مليئة الركيزة الصلبة مع سطحها الظهرية على الركيزة.
باستخدام ثلاث إبر قياس 23 معقمة ، قم بصب الحانة على الطبق بإبرة واحدة تحت كل ذراع وإبرة ثالثة عبر الفم لفرط الرقبة بعناية. قطع من خلال الجلد في منطقة الرقبة باستخدام ملقط غرامة معقمة لفضح الغدد اللعابية تحت. إزالة هذه الغدد باستخدام ملقط غرامة.
حدد مكان عضلات الروثوما وomohyoid بالقرب من الترقوة والقصبة الهوائية على التوالي. أولاً، قطع عضلات القصر العرضية. ثم قطع بعناية العضلات omohyoid رقيقة باستخدام ملقط غرامة.
وبمجرد إزالة هذه العضلات، فإن التشعب في الشريان السباتي على الطرف الأمامي، تكون مرئية على جانبي القصبة الهوائية مع SCG تقع تحت هذه الشوكة في الشريان السباتي. باستخدام ملقط مغلقة، رفع بلطف الشريان السباتي لتصور SCG. باستخدام ملقط واحد على جانبي SCG، اسحب السباتي ونقله إلى أطباق 35 ملليمتر المعقمة المعدة.
هذا النسيج سوف تحتوي على الأرجح SCG مع الشريان السباتي, العصب المبهم مع ganglia الإيماءة, فضلا عن أجزاء أخرى من العضلات أو الدهون في المنطقة. كرر عملية التشريح على الجانب الآخر. إزالة SCGs من جميع الأجنة قبل الاستمرار في خطوات التشريح المتبقية المبينة.
توزيع الأنسجة المعزولة بين اثنين من الأطباق 35 ملليمتر لتسهيل معالجة عينات الأنسجة. مرحلة ما بعد تجهيز SCG. لفصل SCG من الأنسجة تشريح، أولا استخدام ملقط غرامة لإزالة أي الأنسجة الدخيلة، مثل العضلات أو الدهون، مع الحرص على تجنب المنطقة بالقرب من التشعب السباتي.
بمجرد إزالة هذه الأنسجة ، اثنين من ganglia مرئية. العقدة الإيماءة أصغر حجماً ودائرية في حين أن SCG هو اللوز على شكل. سحب بلطف على العصب المبهم لفصل العصب المبهم والعصابة الإيماءة من السباتي ومن ثم فصل SCG من الشريان السباتي.
استخدم ملقط ناعم لإزالة الكبسولة التي تحيط بـ SCG. نقل SCG إلى طبق جديد ثقافة 35 ملليمتر. كرر هذه العملية مع جميع عينات الأنسجة تشريح.
معطف ماصات زجاجية معقمة، مُسدّس بالقطن مع وسائلُ تشريح لمنع الأنسجة من التمسك بجدران الماصات. استخدام ماصة لاستبدال وسائل الإعلام تشريح مع مللتين معقمة من نوع الكولاجين الثاني، dispase نوع الثاني في HBSS الكالسيوم والمغنيسيوم خالية من واحتضان لمدة 50 دقيقة في 37 درجة مئوية للمساعدة في كسر الأنسجة. لاحظ أن أوقات الحضانة قد تحتاج إلى تحسين مع دفعات مختلفة من الكولاجين / dispase وعادة ما تتراوح بين 40 دقيقة إلى ساعة.
بعد الحضانة، ونقل SCGs والكولاجيناز / dispase إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر معقمة. استخدام وسائل الإعلام تشريح لشطف لوحات ونقل الحل إلى أنبوب. إضافة ما يكفي من وسائل الإعلام تشريح لجعل وحدة التخزين إلى ما يقرب من 10 ملليلتر.
أجهزة الطرد المركزي في 200 × ز، 1، 000 إلى 1، 200 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ل بيليه العينة. الطامح المابير، مع الحرص على عدم طرد بيليه. Resuspend بيليه مع 10 ملليلتر من وسائل الإعلام تشريح، وتكرار الطرد المركزي والتخلص من عظمى.
استبدال ب 1-2 ملليلتر من الثقافة المتوسطة. باستخدام ماصة باستور الضيقة، عازمة تلميح معقمة، قبل معطفه مع المتوسطة الثقافة، تفكيك ميكانيكيا الكتل عن طريق triturating بلطف خمس إلى ست مرات. السماح لأكبر كتل تسوية لمدة دقيقة واحدة تقريبا ونقل تعليق الخلية الفائقة إلى أنبوب جديد 10 ملليلتر.
كرر هذه العملية ثلاث مرات أخرى مع زيادة قوة التثاقل في كل مرة لضمان تفكك كامل تقريبا من SCGs. نقل افرط بعد كل جولة من التثاقل إلى أنبوب 10 ملليلتر مع عظمى من التثاقل الأول. إضافة ما يكفي من وسائل الإعلام الثقافة لجعل وحدة التخزين إلى ثمانية إلى 10 ملليلتر.
خلط بلطف تعليق الخلية وتحديد كثافة الخلية مع قياس الهيموسيت. توزيع تعليق الخلية في الآبار في كثافة الخلايا المناسبة للتجارب. اخلطي تعليق الخلية باستمرار أثناء عملية الطلاء لضمان التوزيع حتى للخلايا في الآبار.
للتحليل المورفولوجي، صفي الخلايا حول 8000 خلية في بئر في طبق 24-جيدا. وبالنسبة للبروتوكولات الجينومية والبروتيومية، قم بطبقة الخلايا التي يصل ارتفاعها إلى 30,000 خلية في البئر. نقل لوحات إلى مجفف الزجاج مع الماء المعقم في الجزء السفلي لإنشاء غرفة مرطبة.
حقن ما يكفي من ثاني أكسيد الكربون، حوالي 120 ملليلتر، للحصول على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون في بيئة في desiccator، قبل الختم. الحفاظ على لوحات في 35.5 درجة مئوية. ويشار إلى هذا اليوم صفر في البروتوكول.
ويمكن أيضا الحفاظ على هذه اللوحات في حاضنة CO2 5٪ العادية. الطريقة المذكورة أعلاه يقلل من درجة الحرارة ودرجة الحرارة التغيرات ويساعد أيضا على منع التلوث المتبادل. صيانة الخلايا العصبية SCG مثقف والعلاجات.
تُظهر هذه الصور خلايا العقدة العنقية المُفصلة في اليوم صفر، واليوم الأول، واليوم الخامس. تظهر صورة اليوم الصفر الخلايا عند الطلاء. الخلايا مطلية في اليوم صفر تحتوي على خليط من الخلايا العصبية وغير العصبية على حد سواء.
في اليوم الأول، بعد 24 ساعة من الطلاء، قم بإزالة نصف وسائل الإعلام الثقافية بعناية واستبدلها باثنين من الميكروفولار آرا-سي، سيتوسين د-أربينوفورانويدي، وهو عامل مضاد للميتوتيك. ترك العلاج على الخلايا لمدة 48 ساعة. عادة هذا طول العلاج يكفي للقضاء على الخلايا غير العصبية في الثقافة.
في اليوم الثالث، يُشعّر برفق نصف الوسط ويُستعاض عنه بوسيلة التحكم. في اليوم الرابع، تكون الخلايا جاهزة للعلاج التجريبي. تغذية الثقافات كل يومين مع وسيلة مناسبة.
استبدال بلطف نصف المتوسط في البئر مع المتوسطة الطازجة. الصورة في اليوم الخامس يظهر نمو محور عصبي واسعة النطاق مع عدم وجود نمو تشعب لوحظ. للحث على النمو التشعبي, يمكن أن تزرع الخلايا العصبية على Matrigel أو تعامل مع المصل 10٪ أو 50 نانوغرام لكل ملليلتر من البروتين مورفوجينيك العظام-7.
يظهر الشكل الثاني التغيرات في مورفولوجيا الخلايا العصبية من الخلايا العصبية SCG الفئران E21 بعد العلاج مع BMP-7. تظهر ميكروجرافات التخومات على النقيض من المرحلة التمثيلية في 10 X تكبير جسم الخلايا العصبية الدائري مع محاور عصبية في الخلايا العصبية التحكم في اللوحة A، والخلايا العصبية مع عمليات متعددة تشبه التشعب القصير عند التعامل مع BMP-7 التي تظهرها الأسهم في الخلايا العصبية B.Cultured SCG بعد العلاجات المناسبة يمكن استخدامها للتحليل المورفولوجي باستخدام التلطخ الكيميائي المناعي للتحليل الجينومي والدراسات الكيميائية الحيوية ، مثل لتحليلات البروتيوم. راجع المخطوطة للحصول على بروتوكولات مفصلة للمناعة وإعداد العينات لتحليل البروتيوم.
يظهر الشكل الثالث مناعة من بروتين MAP-2 في الخلايا العصبية المتعاطفة للفئران الجنينية المستزرعة. لوحات من خلال D تظهر الخلايا العصبية SCG مثقف تعامل مع وسائل الإعلام التحكم والألواح E من خلال H تظهر الخلايا العصبية تعامل مع BMP-7 في 50 نانوغرام لكل ملليلتر لمدة خمسة أيام. ميكروجراف تمثيلية تظهر تلطيخ مناعة الخلايا العصبية مع microtubule المرتبطة البروتين-2 في C و G، وصمة عار نووية في D و H مع مرحلة التباين المجهري في B و F، والخروج من القنوات الثلاث في A و D.Immunocytochemical تلطيخ من البروتينات المرتبطة microtubule-2 موجود في جسم الخلية ومحورات العجلة القريبة من الخلايا العصبية التحكم في لوحة C.و ، وdendrites في BMP-7 الخلايا العصبية المعالجة في لوحة G.Here هي عينة من العقدة عنق الرحم متفوقة تعامل مع وسائل الإعلام التحكم، والتي اكتشفت 1، 100 البروتينات.
وجد علم الأجناس الجينية باستخدام قاعدة بيانات الفهود أن معظم البروتينات كانت سيتوبلازميك. ومع ذلك، كانت هناك بروتينات ومقيدة بالغشاء في الوصلات الخلوية في العينة. وكشف هذا التحليل أيضا أن البروتينات التي تشارك في مجموعة واسعة من مسارات إشارات الخلايا العصبية تم الكشف عنها في العينة.
في الختام، بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادرة على عزل وثقافة الجرذ الجنينية الجنينية العصبية العقدية العنقية للتحليل المورفولوجي والبروتيومية. تم تمويل هذا العمل من قبل صندوق تطوير الكلية وبرنامج البحوث الصيفية في كلية سانت ماري في كاليفورنيا.
