Dans cette vidéo, nous démontrerons la culture des ganglions cervicaux supérieurs des rats embryonnaires pour l’analyse morphologique et protéomique. Avant de commencer la dissection, préparez les supports de contrôle et de dissection. Le milieu de contrôle contient F-12 et le DMEM de bas glucose complétés avec un mélange insuline-sélénium-transferrin, glutamine, facteur de croissance de nerf, et BSA.
Le milieu de dissection contient L-15 complété avec le stylo-strep et le BSA. Reportez-vous au manuscrit pour obtenir des protocoles détaillés pour la préparation des médias. Préparation des plaques pour la culture des neurones.
Diluer un milligramme par millilitre de poly-D-lysine à 100 microgrammes par millilitre avec de l’eau distillée stérile. Pour l’analyse protéomique ou génomique, un à deux jours avant la dissection, enduire les plaques de six puits d’environ deux millilitres de stérile 100 grammes par millilitre de poly-D-lysine. Ceci est nécessaire pour assurer l’adhérence cellulaire au puits.
Envelopper les assiettes d’un film accrocheur et conserver les assiettes toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le jour de la dissection, avant le début de la dissection, retirez la solution poly-D-lysine des puits et rincez les puits cinq fois à l’eau distillée stérile, suivie d’une fois avec du DMEM à faible teneur en glucose. Pendant la digestion enzymatique des ganglions, environ une heure avant le placage des cellules, aspirer le DMEM des plaques et le remplacer par 0,3 millilitres de milieu de contrôle.
Conserver les assiettes à 35 degrés Celsius sous 5 % de CO2 dans une chambre humidifiée. Dans le capot, configurer les éléments suivants pour la dissection. Quatre tubes coniques stériles de 50 millilitres avec environ 20 millilitres de médias de dissection dans chaque tube.
Quatre plats stériles de 35 millimètres avec 1,5 millilitres de médias de dissection. Un tube conique stérile de 50 millilitres avec 20 millilitres de médias de dissection pour la centrifugation. Un tube conique stérile de 15 millilitres pour centrifuger les ganglions, un tube stérile de 10 millilitres pour la collecte des cellules dissociées.
Utilisez un stérilisateur de perles sèches pour stériliser une paire de forceps fins pendant au moins une minute. Toutes les procédures effectuées dans le cadre d’études portant sur des animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee du Saint Mary’s College of California. Les lignes directrices sur les soins et l’utilisation des animaux au Saint Mary’s College of California ont été élaborées sur la base de lignes directrices fournies par l’Office of Laboratory Animal Welfare des National Institutes for Health.
Retrait des embryons E21 du rat enceinte. Notez que l’ablation de la corne utérine peut être effectuée à l’extérieur du capot si la zone environnante est complètement stérilisée. Euthanasier un rat enceinte par inhalation de CO2.
Cisaillez la fourrure de la région abdominale et essuyez la peau dans la région avec 70% d’alcool pour la stériliser. À l’aide d’un nouvel ensemble de ciseaux stériles et de forceps, couper à travers la peau, puis le muscle pour exposer les cornes utérinnes contenant les embryons. Retirer la corne utérine avec les embryons, à l’aide d’un nouvel ensemble de ciseaux et de forceps, en prenant soin de ne pas endommager les intestins dans le processus.
Transférer la corne utérine avec les embryons dans une boîte de Pétri stérile de 150 millimètres et les transférer dans le capot. À l’aide d’un nouvel ensemble de forceps et de ciseaux, retirer les embryons de la corne utérine et séparer les embryons des membranes amniotiques et du placenta. Pour euthanasier les embryons, couper la moelle épinière des embryons le long de la ligne médiane sous le bras droit.
Ceci réduira le saignement de l’artère carotide pendant l’enlèvement du SCG. Transférez ces embryons dans les tubes coniques préparés de 50 millilitres contenant des supports de dissection. Assurez-vous que les embryons sont immergés dans les médias.
Chaque tube peut contenir jusqu’à trois embryons. Isolement du ganglion cervical supérieur de l’embryon. Transférer un chiot du média de dissection sur une boîte petri stérile de 150 millimètres à moitié remplie de substrat solide avec sa surface dorsale sur le substrat.
À l’aide de trois aiguilles stériles de calibre 23, épinglez le pub au plat avec une aiguille sous chaque bras et une troisième aiguille par la bouche pour hyperextendre soigneusement le cou. Couper à travers la peau dans la région du cou à l’aide de forceps fines stériles pour exposer les glandes salivaires en dessous. Retirez ces glandes à l’aide de forceps fins.
Localiser les muscles sternocleidomastoid et omohyoid près de la clavicule et de la trachée respectivement. Tout d’abord, couper les muscles transversaux sternocleidomastoid. Et puis couper soigneusement le muscle omohyoïde mince à l’aide de forceps fines.
Une fois ces muscles enlevés, la bifurcation dans l’artère carotide à l’extrémité antérieure, sera visible de chaque côté de la trachée avec le SCG situé sous cette fourchette dans l’artère carotide. À l’aide de forceps fermés, soulevez doucement l’artère carotide pour visualiser le SCG. À l’aide d’un forceps de chaque côté du SCG, retirez le carotide et transférez-le dans les plats stériles préparés de 35 millimètres.
Ce tissu contiendra très probablement le SCG avec l’artère carotide, le nerf vague avec les ganglions de nodose, aussi bien que d’autres segments de muscle ou de graisse dans la région. Répétez le processus de dissection de l’autre côté. Retirer les CSG de tous les embryons avant de poursuivre les étapes de dissection restantes décrites.
Répartir les tissus isolés entre deux des plats de 35 millimètres pour faciliter le traitement des échantillons de tissus. Post-traitement du SCG. Pour séparer le SCG du tissu disséqué, utilisez d’abord des forceps fins pour enlever tout tissu extranieux, comme le muscle ou la graisse, en prenant soin d’éviter la zone près de la bifurcation carotide.
Une fois ces tissus enlevés, deux ganglions sont visibles. Le ganglion de nodose est plus petit et circulaire tandis que le SCG est en forme d’amande. Tirez doucement sur le nerf vague pour séparer le nerf vague et les ganglions de nodose du carotide, puis séparez le SCG de l’artère carotide.
Utilisez des forceps fins pour enlever la capsule qui entoure SCG. Transférer le SCG dans un nouveau plat de culture de 35 millimètres. Répétez ce processus avec tous les échantillons de tissus disséqués.
Enduire une pipette en verre stérilisée et branchée au coton d’un média de dissection pour empêcher le tissu d’adhérer aux parois de la pipette. Utilisez la pipette pour remplacer le média de dissection par deux millilitres stériles de type II de collagène, dispase de type II en calcium et sans magnésium HBSS et incuber pendant 50 minutes à 37 degrés Celsius pour aider à décomposer les tissus. Notez que les temps d’incubation peuvent devoir être optimisés avec différents lots de collagène/dispase et varient généralement de 40 minutes à une heure.
Après l’incubation, transférer les CSG et la collagène/dispase dans un tube conique stérile de 15 millilitres. Utilisez le média de dissection pour rincer les plaques et transférer la solution dans le tube. Ajouter suffisamment de supports de dissection pour porter le volume à environ 10 millilitres.
Centrifugeuse à 200 x g, 1000 à 1200 rpm pendant cinq minutes à température ambiante pour granuler l’échantillon. Aspirer le surnatant, en prenant soin de ne pas déloger la pastille. Resuspendez la pastille avec 10 millilitres de médias de dissection, répétez la centrifugation et jetez le supernatant.
Remplacer par un à deux millilitres de milieu culturel. À l’aide d’une pipette Pasteur stérile à pointe étroite à pointe pliée, pré-enduire d’un milieu de culture, dissocier mécaniquement les touffes en triturant doucement cinq à six fois. Laissez les touffes plus grosses se contenter d’environ une minute et transférer la suspension cellulaire supernatante dans un nouveau tube de 10 millilitres.
Répétez ce processus trois fois de plus avec une force croissante de trituration à chaque fois pour assurer une dissociation presque complète des CSG. Transférez le supernatant après chaque cycle de trituration au tube de 10 millilitres avec le supernatant dès la première trituration. Ajoutez suffisamment de médias culturels pour porter le volume à huit à 10 millilitres.
Mélanger délicatement une suspension cellulaire et quantifier la densité cellulaire à l’aide d’un hémomètre. Répartir la suspension cellulaire dans les puits à la densité cellulaire appropriée pour les expériences. Mélanger continuellement la suspension cellulaire pendant le processus de placage pour assurer une distribution uniforme des cellules dans les puits.
Pour l’analyse morphologique, plaquez les cellules autour de 8000 cellules par puits dans une plaque de 24 puits. Et pour les protocoles génomiques et protéomiques, plaquez les cellules jusqu’à 30 000 cellules par puits. Transférer les plaques dans un dessiccateur en verre avec de l’eau stérile au fond pour créer une chambre humidifiée.
Injecter suffisamment de CO2, environ 120 millilitres, pour obtenir un environnement de 5% de CO2 dans le dessiccateur, avant l’étanchéité. Maintenir les plaques à 35,5 degrés Celsius. C’est ce qu’on appelle le jour zéro dans le protocole.
Ces plaques peuvent également être maintenues dans un incubateur régulier de 5 % de CO2. La méthode décrite ci-dessus minimise les changements de température et de pH et aide également à prévenir la contamination croisée. Entretien des neurones et des traitements SCG cultivés.
Ces images montrent les cellules supérieures dissociées de ganglions cervicaux le jour zéro, le premier jour, et le cinquième jour. L’image du jour zéro montre les cellules sur le placage. Les cellules plaquées le jour zéro contiennent un mélange de cellules neuronales et non neuronales.
Le premier jour, 24 heures après le placage, retirez soigneusement la moitié des médias de culture et remplacez-les par deux micromolaires Ara-C, cytosine D-arabinofuranoside, un agent anti-mitotique. Laissez le traitement sur les cellules pendant 48 heures. Habituellement, cette durée de traitement est suffisante pour éliminer les cellules non neuronales dans la culture.
Le troisième jour, aspirer doucement la moitié du milieu et remplacer par un moyen de contrôle. Le quatrième jour, les cellules sont prêtes pour des traitements expérimentaux. Nourrir les cultures tous les deux jours avec le support approprié.
Remplacer délicatement la moitié du milieu dans le puits par un milieu frais. L’image le cinquième jour montre la croissance axonale étendue sans croissance dendritique observée. Pour induire la croissance dendritique, les neurones peuvent être cultivés sur Matrigel ou traités avec 10% sérum ou 50 nanogrammes par millilitre de protéines morphogénétiques osseuses-7.
La figure deux montre des changements dans la morphologie neuronale des neurones SCG de rat E21 suivant le traitement avec BMP-7. Les micrographes représentatifs de contraste de phase à 10 X grossissement montrent le corps neuronal circulaire de cellules avec des axones dans les neurones de contrôle dans le panneau A, et les neurones avec de multiples processus courts dendrite-comme une fois traités avec BMP-7 montré par les flèches dans le panneau B.Cultured SCG neurones suivant les traitements appropriés peuvent être employés pour l’analyse morphologique utilisant la coloration immunocytochimique pour l’analyse génomique et pour des études biochimiques , comme pour les analyses protéomiques. Se référer au manuscrit pour obtenir des protocoles détaillés d’immunostaining et de préparation d’échantillons pour l’analyse protéomique.
La figure trois montre l’immunostaining de la protéine MAP-2 dans les rats embryonnaires cultivés neurones sympathiques. Les panneaux A à D montrent des neurones SCG cultivés traités avec des supports de contrôle et des panneaux E à H montrent des neurones traités avec BMP-7 à 50 nanogrammes par millilitre pendant cinq jours. Micrographes représentatifs montrant la coloration immunocytochimique des neurones avec la protéine-2 associée de microtubule dans C et G, une tache nucléaire dans D et H avec des micrographes de contraste de phase dans B et F, et émergent des trois canaux dans la coloration a et d.immunocytochimique de la protéine associée de microtubule-2 est présente dans le corps cellulaire et les axones proximaux des neurones de contrôle dans le panneau C.Et la coloration de la protéine MAP-2 dans le corps cellulaire , et les dendrites dans les neurones traités BMP-7 est dans le panneau G.Voici un échantillon de ganglions cervicaux supérieurs traités avec des supports de contrôle, qui a détecté 1100 protéines.
L’ontologie génétique utilisant la base de données Panther a révélé que la plupart des protéines étaient cytoplasmiques. Cependant, il y avait des protéines et des protéines liées à la membrane aux jonctions cellulaires dans l’échantillon. Cette analyse a également révélé que des protéines qui sont impliquées dans un large éventail de voies de signalisation neuronale ont été détectées dans l’échantillon.
En conclusion, après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure d’isoler et de la culture rat embryonnaires supérieurs neurones ganglionnaires cervicaux pour l’analyse morphologique et protéomique. Ces travaux ont été financés par le fonds de développement du corps professoral et le programme de recherche d’été du Saint Mary’s College of California.
