本ビデオでは、形態学的およびプロテオミクス解析のための胚性ラットの優れた子宮頸神経節の培養を実証する。解剖を始める前に、制御と解剖メディアを準備してください。コントロール培地には、インスリンセレントランスフェリン混合物、グルタミン、神経成長因子、およびBSAを添加したF-12および低グルコースDMEMが含まれています。
解剖媒体はペンストレップおよびBSAと補足されるL-15を含んでいる。メディアの準備のための詳細なプロトコルについては、原稿を参照してください。ニューロンを培養するためのプレートの調製
ポリD-リジンの1ミリリットルのストックあたり1ミリグラムを滅菌蒸留水で1ミリリットル当たり100マイクログラムに希釈する。解剖の1~2日前に、解剖の1~2日前に、ポリD-リジン1ミリリットル当たり約2ミリリットルの無菌100グラムで6ウェルプレートをコーティングします。これは、ウェルへの細胞接着を確保するために必要です.
プレートをしがみつくフィルムで包み、プレートを摂氏4度で一晩保管します。解剖の日には、解剖が始まる前に、ポリD-リジン溶液を井戸から取り出し、滅菌蒸留水で井戸を5回リンスし、続いて低グルコースDMEMで1回ずつすすがします。神経節の酵素消化中、細胞をめっきする約1時間前に、DMEMをプレートから吸引し、0.3ミリリットルの制御培地に置き換える。
5%CO2以下で35°Cのプレートを加湿したチャンバーに保管してください。フード内で、解剖用に以下の項目を設定します。各チューブに約20ミリリットルの解剖媒体を有する4つの50ミリリットルの無菌の円錐管。
解剖媒体の1.5ミリリットルと4つの無菌35ミリメートルの皿。1つの無菌50ミリリットル円錐管と20ミリリットルの解剖媒体を遠心分離する。神経節を遠心分離するための15ミリリットルの無菌円錐管1本、解約細胞を回収するための1つの無菌10ミリリットルチューブ。
乾燥ビーズ滅菌器を使用して、1対の細かい鉗子を少なくとも1分間殺菌します。動物を含む研究で行われたすべての手順は、カリフォルニア州セントメアリーズカレッジの制度動物ケアと使用委員会によって承認されました。カリフォルニア州セントメアリーズカレッジの動物ケアと使用ガイドラインは、国立衛生研究所の動物福祉研究所が提供するガイドラインに基づいて開発されました。
妊娠中のラットからのE21胚の除去。なお、周囲の領域が完全に殺菌されれば、子宮ホーンの除去はフードの外側で行うことができる。妊娠中のラットをCO2吸入で安楽死させる。
腹部の領域から毛皮を剪断し、それを殺菌するために70%アルコールで領域内の皮膚を拭きます。無菌ハサミと鉗子の新鮮なセットを使用して、皮膚を切断し、次に筋肉を切断し、胚を含む子宮の角を露出させる。胚で子宮角を取り除き、新しいハサミと鉗子を使用して、その過程で腸に損傷を与えないように注意してください。
胚を持つ子宮ホーンを150ミリメートルの無菌ペトリ皿に移し、フードに移します。鉗子とはさみの新しいセットを使用して、子宮の角から胚を取り除き、羊膜と胎盤から胚を分離する。胚を安楽死させるために、右腕の下の正中線に沿って胚の脊髄を切断する。
これは、SCGの除去中に頸動脈からの出血を減少させる。これらの胚を解剖培地を含む調製された50ミリリットルの円錐管に移す。胚がメディアに沈んでいるか確認してください。
各チューブは、最大3つの胚を保持することができます。胚からの上頸神経節の分離。解剖培地から1つの子犬を、基板上の後ろ面を持つ固体基板で半分充填された無菌150ミリメートルのペトリ皿に移します。
3つの無菌23ゲージ針を使用して、各腕の下に1本の針を持ち、口を通して3本目の針でパブを皿に固定し、首を慎重に伸ばします。下の唾液腺を露出させるために無菌の細かい鉗子を使用して首の領域の皮膚を切断します。細かい鉗子を使用してこれらの腺を取り除きます。
鎖骨と気管の近くに胸骨筋とオモヨイドの筋肉をそれぞれ見つけます。まず、横断性胸骨筋筋を切断する。そして、細いオモヨイド筋を細い鉗子で丁寧に切ります。
これらの筋肉が取り除かれると、前側端の頸動脈の分岐は、頸動脈のこのフォークの下に位置するSCGを有する気管の両側に見える。閉じた鉗子を使用して、頸動脈を静かに持ち上げてSCGを視覚化する。SCGの両側に1つの鉗子を使用して、頸動脈を引き出し、準備された無菌35ミリメートルの皿に移す。
この組織は、頸動脈を有するSCG、無用量神経節を有する迷走神経、ならびに領域内の筋肉または脂肪の他のセグメントを含む可能性が最も高い。反対側で解剖プロセスを繰り返します。概説された残りの解剖ステップを続行する前に、すべての胚からSCGを取り除きます。
組織サンプルの処理を容易にするために、35ミリメートルの皿のうちの2つの間で単離された組織を分配する。SCGの後処理。SCGを解剖組織から分離するには、まず細かい鉗子を使用して筋肉や脂肪などの余分な組織を取り除き、頸動脈分岐の近くの領域を避けるように注意する。
これらの組織が取り除かれると、2つの神経節が見える。SCGがアーモンド状である間、無用量ガングリオンは小さく円形である。迷走神経を優しく引っ張って迷走神経と無用量神経節を頸動脈から分離し、頸動脈からSCGを分離する。
SCGを取り囲むカプセルを取り除くために細かい鉗子を使用してください。SCGを新しい35ミリメートルの培養皿に移します。解剖された組織サンプルをすべて使用して、このプロセスを繰り返します。
滅菌された綿製のガラスピペットに解剖媒体をコーティングし、組織がピペットの壁に付着するのを防ぎます。ピペットを使用して、解剖培地をコラゲターゼII型の無菌2ミリリットル、カルシウムとマグネシウムフリーHBSSのディスパーゼII型に置き換え、37°Cで50分間インキュベートして組織を分解します。インキュベーション時間は、コラゲラーゼ/ディスパーゼの異なるバッチで最適化する必要があり、通常は40分から1時間の範囲であることに注意してください。
インキュベーションに続いて、SCGとコラゲナーゼ/ディスパーゼを無菌15ミリリットル円錐形チューブに移します。解剖培地を使用してプレートをすすい、チューブに溶液を移します。約10ミリリットルにボリュームを持って来るために十分な解剖媒体を追加します。
200xgで遠心分離機、1,000〜1、200rpmを室温で5分間、試料をペレットする。上清を吸引し、ペレットを外さないよう注意する。ペレットを10ミリリットルの解剖培地で再懸濁し、遠心分離を繰り返し、上清を捨てます。
1~2ミリリットルの培養培地に交換してください。狭孔、曲げ先端滅菌パスツールピペットを使用して、培養培地で事前にコーティングし、5〜6回穏やかに三度引きすることによって塊を機械的に解別する。大きな塊を約1分間落ち着かせ、上清細胞懸濁液を新しい10ミリリットルチューブに移します。
SCGのほぼ完全な解離を確実にするために、毎回トリアーレーションの力を増やすとこのプロセスをさらに3回繰り返します。8〜10ミリリットルにボリュームをもたらすのに十分な培養培地を追加します。
細胞懸濁液を軽く混合し、ヘモサイトメーターで細胞密度を定量化します。実験に適した細胞密度で細胞懸濁液をウェルに分配する。めっきプロセス中に細胞懸濁液を継続的に混合し、ウェルへの細胞の均等な分布を確保します。
形態学的分析のために、24ウェルプレートにウェルあたり8,000個の細胞の周りをプレートします。ゲノムおよびプロテオミクスプロトコルの場合、細胞を1ウェルあたり30,000個の細胞にプレートします。プレートを下部に滅菌水を入ったガラスデシケーターに移し、加湿チャンバーを作ります。
十分なCO2を注入し、約120ミリリットル、封止前にデシケータで5%のCO2環境を得る。プレートを摂氏35.5度に保つ。これは、プロトコルではゼロ日と呼ばれます。
これらのプレートは、通常の5%CO2インキュベーターで維持することもできます。上記の方法は、温度とpHの変化を最小限に抑え、また、クロス汚染を防ぐのに役立ちます。培養されたSCGニューロンおよび治療の維持。
これらの写真は、ゼロ日目、1日目、5日目に解約された優れた子宮頸神経細胞を示しています。ゼロ画像は、めっき時の細胞を示しています。ゼロ日目にメッキされた細胞には、神経細胞と非神経細胞の両方の混合物が含まれています。
めっきの24時間後の1日目に、培養培地の半分を慎重に取り出し、2つのミクロモルAra-C、シトシンD-アラビノフラノシド、抗ミトティック剤に置き換えます。48時間細胞に治療を残します。通常、この治療期間は、培養中の非神経細胞を排除するのに十分である。
3日目には、培地の半分を軽く吸い込み、制御媒体に交換します。4日目、細胞は実験的治療の準備ができています。適切な培地で一日おきに培養を供給する。
井戸の中の半分を新鮮な媒体にそっと置き換えます。5日目の画像は、樹状突起の成長が観察されていない広範な軸索成長を示しています。樹状成長を誘導するために、ニューロンはマトリゲル上で増殖させるか、骨形態形成タンパク質-7の1ミリリットル当たり10%血清または50ナノグラムで処理することができる。
図2は、BMP-7による治療後のE21ラットSCGニューロンの神経形態の変化を示す。10 X倍率の代表的な位相コントラスト顕微鏡写真は、パネルAの対照ニューロンに軸索を持つ円形ニューロン細胞体と、パネルB.Cultured SCGニューロンの矢印で示されたBMP-7で処理された複数の短い樹状突起様プロセスを有するニューロンを示し、適切な治療に続く適切な治療に続く形態学的分析に使用することができる。などのプロテオミクス分析用。プロテオミクス分析のための免疫染色およびサンプル調製のための詳細なプロトコルについては、原稿を参照してください。
図3は、培養胚性ラット交感ニューロンにおけるMAP-2タンパク質からの免疫染色を示す。パネルAからDは、制御メディアとHを介してパネルEで治療された培養SCGニューロンを示し、5日間1ミリリットル当たり50ナノグラムでBMP-7で処理されたニューロンを示す。CおよびGにおける微小管関連タンパク質-2を有するニューロンの免疫細胞化学的染色を示す代表的な顕微鏡写真、 BおよびFの位相コントラスト顕微鏡写真を有するDおよびHの核染色、および微小管関連タンパク質−2からの免疫細胞化学的染色の3つのチャネルの出現は、パネルCの対照ニューロンの細胞体および近位軸索に存在し、細胞体内のMAP-2タンパク質から染色する、およびBMP-7処理ニューロンの樹状突起は、パネルGにあるコントロールメディアで処理された優れた子宮頸神経節のサンプルランであり、1,100個のタンパク質を検出した。
パンサーデータベースを使用した遺伝子オントロジーは、タンパク質のほとんどが細胞質であることを発見しました。しかし、サンプル中の細胞接合部には膜結合タンパク質とタンパク質が存在していた。この分析は、広範囲の神経シグナル伝達経路に関与するタンパク質がサンプル中に検出されたことも明らかにした。
結論として、このビデオを見た後、形態学的およびプロテオミクス分析のためにラット胚性優れた子宮頸神経節ニューロンを分離し培養することができるはずです。この研究は、カリフォルニア州セントメアリーズカレッジの教員開発基金と夏の研究プログラムによって資金提供されました。
