In questo video, dimostrazioneremo la coltivazione dei gangli cervicali superiori dei ratti embrionali per l'analisi morfologica e proteomica. Prima di iniziare la dissezione, preparare i supporti di controllo e dissezione. Il mezzo di controllo contiene F-12 e DMEM a basso glucosio integrati con una miscela insulino-selenio-transferrina, glutammina, fattore di crescita nervosa e BSA.
Il mezzo di dissezione contiene L-15 integrato con pen-strep e BSA. Fare riferimento al manoscritto per protocolli dettagliati per la preparazione dei media. Preparazione di piastre per la coltivatorie dei neuroni.
Diluire un milligrammo per millilitro stock di poli-D-lsina a 100 microgrammi per millilitro con acqua distillata sterile. Per l'analisi proteomica o genomica, da uno a due giorni prima della dissezione, rivestire piastre a sei pozzetti con circa due millilitri di sterile 100 grammi per millilitro di poli-D-lsina. Questo è necessario per garantire l'adesione cellulare al pozzo.
Avvolgere i piatti con pellicola aggrappata e conservare i piatti durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno della dissezione, prima dell'inizio della dissezione, rimuovere la soluzione di poli-D-lisina dai pozzi e sciacquare i pozzi cinque volte con acqua distillata sterile, seguita da una volta con DMEM a basso glucosio. Durante la digestione enzimatica dei gangli, circa un'ora prima di placcare le cellule, aspirare il DMEM dalle piastre e sostituirlo con 0,3 millilitri di mezzo di controllo.
Conservare le piastre a 35 gradi Celsius sotto il 5%CO2 in una camera umidificata. Nella cappa impostare i seguenti elementi per la dissezione. Quattro tubi conici sterili da 50 millilitri con circa 20 millilitri di mezzi di dissezione in ogni tubo.
Quattro piatti sterili da 35 millimetri con 1,5 millilitri di mezzi di dissezione. Un tubo conico sterile da 50 millilitri con 20 millilitri di mezzi di dissezione per la centrifugazione. Un tubo conico sterile da 15 millilitri per centrifugare i gangli, un tubo sterile da 10 millilitri per la raccolta delle cellule dissociate.
Utilizzare uno sterilizzatore di perline secche per sterilizzare un paio di forcep fini per almeno un minuto. Tutte le procedure eseguite in studi che coinvolgono animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee del Saint Mary's College of California. Le linee guida per la cura e l'uso degli animali al Saint Mary's College of California sono state sviluppate sulla base delle linee guida fornite dall'Office of Laboratory Animal Welfare presso il National Institutes for Health.
Rimozione di embrioni E21 dal ratto incinta. Si noti che la rimozione del corno uterino può essere eseguita al di fuori del cappuccio se l'area circostante è completamente sterilizzata. Eutanasia un topo incinta con inalazione di CO2.
Tosare la pelliccia dalla regione addominale e pulire la pelle nell'area con il 70% di alcol per sterilizzarla. Utilizzando un nuovo set di forbici sterili e forcep, tagliare la pelle e quindi il muscolo per esporre le corna uterine contenenti gli embrioni. Rimuovere il corno uterino con gli embrioni, utilizzando un nuovo set di forbici e forcep, facendo attenzione a non danneggiare l'intestino nel processo.
Trasferire il corno uterino con gli embrioni in una piastra di Petri sterile da 150 millimetri e trasferirli nel cappuccio. Utilizzando un nuovo set di pini e forbici, rimuovere gli embrioni dal corno uterino e separare gli embrioni dalle membrane amniotiche e dalla placenta. Per eutanasiare gli embrioni, tagliare il midollo spinale degli embrioni lungo la linea mediana sotto il braccio destro.
Ciò ridurrà il sanguinamento dall'arteria carotide durante la rimozione del SCG. Trasferire questi embrioni nei tubi conici preparati da 50 millilitri contenenti mezzi di dissezione. Assicurarsi che gli embrioni siano immersi nei media.
Ogni tubo può contenere fino a tre embrioni. Isolamento del ganglio cervicale superiore dall'embrione. Trasferire un cucciolo dal mezzo di dissezione su una piastra di Petri sterile di 150 millimetri semi-riempita con substrato solido con la sua superficie dorsale sul substrato.
Utilizzando tre aghi sterili calibro 23, pin il pub al piatto con un ago sotto ogni braccio e un terzo ago attraverso la bocca per iperestreminare attentamente il collo. Tagliare la pelle nella regione del collo usando forcep fini sterili per esporre le ghiandole salivari sottostanti. Rimuovere queste ghiandole usando forcep sottili.
Individuare i muscoli sternocleidomastoide e omoioidi rispettivamente vicino alla clavicola e alla trachea. In primo luogo, tagliare i muscoli sternocleidomastoidi trasversali. E poi tagliare con cura il sottile muscolo omoioide usando forcep fini.
Una volta rimossi questi muscoli, la biforcazione nell'arteria carotide sull'estremità anteriore, sarà visibile su entrambi i lati della trachea con il SCG situato sotto questa forchetta nell'arteria carotide. Utilizzando forcep chiuse, sollevare delicatamente l'arteria carotide per visualizzare il SCG. Utilizzando una flessioni su entrambi i lati del SCG, estrarre la carotide e trasferirla ai piatti sterili preparati da 35 millimetri.
Questo tessuto molto probabilmente conterrà il SCG con l'arteria carotide, il nervo vago con i gangli nodosi, così come altri segmenti di muscoli o grassi nella zona. Ripetere il processo di dissezione dall'altra parte. Rimuovere i CMG da tutti gli embrioni prima di continuare con i restanti passaggi di dissezione delineati.
Distribuire i tessuti isolati tra due delle stoviglie da 35 millimetri per facilitare la lavorazione dei campioni di tessuto. Post-elaborazione del SCG. Per separare il SCG dal tessuto sezionato, utilizzare prima le forcelle fini per rimuovere qualsiasi tessuto estraneo, come muscoli o grassi, facendo attenzione a evitare l'area vicino alla biforcazione carotide.
Una volta rimossi questi tessuti, sono visibili due gangli. Il ganglio nodoso è più piccolo e circolare mentre il SCG è a forma di mandorla. Tirare delicatamente il nervo vago per separare il nervo vago e i gangli nodosi dalla carotide e quindi separare il SCG dall'arteria carotide.
Utilizzare forcep fini per rimuovere la capsula che circonda SCG. Trasferisci l'SCG in un nuovo piatto da coltura da 35 millimetri. Ripetere questo processo con tutti i campioni di tessuto sezionati.
Rivestire una pipetta di vetro sterilizzata, collegata in cotone, con mezzi di dissezione per evitare che il tessuto aderisca alle pareti della pipetta. Utilizzare la pipetta per sostituire il mezzo di dissezione con due millilitri sterili di collagenasi di tipo II, dispasi di tipo II in HBSS privo di calcio e magnesio e incubare per 50 minuti a 37 gradi Celsius per aiutare a scomporli. Si noti che i tempi di incubazione potrebbero dover essere ottimizzati con diversi lotti di collagenasi / dispasi e di solito varia da 40 minuti a un'ora.
Dopo l'incubazione, trasferire le SMG e la collagenasi/dispasi in un tubo conico sterile da 15 millilitri. Utilizzare il supporto di dissezione per risciacquare le piastre e trasferire la soluzione sul tubo. Aggiungere abbastanza mezzi di dissezione per portare il volume a circa 10 millilitri.
Centrifuga a 200 x g, da 1.000 a 1.200 giri/min per cinque minuti a temperatura ambiente per pellettare il campione. Aspirare il supernatante, facendo attenzione a non sganciare il pellet. Rimescolare il pellet con 10 millilitri di mezzi di dissezione, ripetere la centrifugazione e scartare il supernatante.
Sostituire con uno o due millilitri di mezzo di coltura. Utilizzando una pipetta Pasteur sterile a foro stretto e piegata, pre-rivestirla con un mezzo di coltura, dissociare meccanicamente i grumi triturando delicatamente da cinque a sei volte. Lasciare che i grumi più grandi si sistemino per circa un minuto e trasferiscano la sospensione cellulare supernatante in un nuovo tubo da 10 millilitri.
Ripetere questo processo altre tre volte con forza crescente di triturazione ogni volta per garantire una dissociazione quasi completa delle SMG. Trasferire il supernatante dopo ogni tondo di triturazione al tubo da 10 millilitri con il supernatante della prima triturazione. Aggiungere abbastanza mezzi di coltura per portare il volume da otto a 10 millilitri.
Mescolare delicatamente una sospensione cellulare e quantificare la densità cellulare con un emocitometro. Distribuire la sospensione cellulare nei pozzi alla densità cellulare appropriata per gli esperimenti. Mescolare continuamente la sospensione cellulare durante il processo di placcatura per garantire una distribuzione uniforme delle cellule nei pozzi.
Per l'analisi morfologica, placcare le cellule intorno a 8.000 cellule per pozzo in una piastra di 24 po '. E per i protocolli genomici e proteomici, placcare le cellule fino a 30.000 cellule per pozzo. Trasferire le piastre in un essiccatore di vetro con acqua sterile sul fondo per creare una camera umidificata.
Iniettare abbastanza CO2, circa 120 millilitri, per ottenere un ambiente di CO2 del 5% nell'essiccatore, prima della sigillatura. Mantenere le piastre a 35,5 gradi Celsius. Questo è indicato come giorno zero nel protocollo.
Queste piastre possono anche essere mantenute in un normale incubatore di CO2 al 5%. Il metodo sopra descritto riduce al minimo le variazioni di temperatura e pH e aiuta anche a prevenire la contaminazione incrociata. Mantenimento dei neuroni e dei trattamenti SCG coltivati.
Queste immagini mostrano le cellule gangli cervicali superiori dissociate il giorno zero, il primo giorno e il quinto giorno. L'immagine del giorno zero mostra le celle al momento della placcatura. Le cellule placcate il giorno zero contengono una miscela di cellule neuronali e non neuronali.
Il primo giorno, 24 ore dopo la placcatura, rimuovere con cura metà del mezzo di coltura e sostituire con due micromolare Ara-C, citosina D-arabinofuranoside, un agente anti-mitotico. Lasciare il trattamento sulle cellule per 48 ore. Di solito questa durata del trattamento è sufficiente per eliminare le cellule non neuronali nella coltura.
Il terzo giorno, aspirare delicatamente metà del mezzo e sostituire con il mezzo di controllo. Il quarto giorno, le cellule sono pronte per trattamenti sperimentali. Nutrire le colture a giorni diversi con il mezzo appropriato.
Sostituire delicatamente metà del mezzo nel pozzo con mezzo fresco. Il quadro del quinto giorno mostra un'ampia crescita assonale senza una crescita dendritica osservata. Per indurre la crescita dendritica, i neuroni possono essere coltivati su Matrigel o trattati con il 10% di siero o 50 nanogrammi per millilitro di proteina morfogenetica ossea-7.
La seconda figura mostra i cambiamenti nella morfologia neuronale dei neuroni SCG del ratto E21 dopo il trattamento con BMP-7. Le micrografie rappresentative del contrasto di fase all'ingrandimento 10 X mostrano il corpo cellulare neuronale circolare con assoni nei neuroni di controllo nel pannello A e neuroni con più processi simili a dendrite corti se trattati con BMP-7 mostrati dalle frecce nei neuroni B.Cultured SCG del pannello seguendo trattamenti appropriati possono essere utilizzati per l'analisi morfologica utilizzando la colorazione immunocitochimica per l'analisi genomica e per studi biochimici , ad esempio per le analisi proteomiche. Fare riferimento al manoscritto per protocolli dettagliati per l'immunostaining e la preparazione del campione per l'analisi proteomica.
La figura tre mostra l'immunostaining dalla proteina MAP-2 nei neuroni simpatici dei ratti embrionali coltivati. I pannelli da A a D mostrano neuroni SCG coltivati trattati con mezzi di controllo e pannelli da E a H mostrano neuroni trattati con BMP-7 a 50 nanogrammi per millilitro per cinque giorni. Micrografie rappresentative che mostrano la colorazione immunocitochimica dei neuroni con proteina associata al microtubulo-2 in C e G, una macchia nucleare in D e H con micrografie a contrasto di fase in B e F, ed emergono dei tre canali in A e D.La colorazione immunocitochimica dalla proteina associata al microtubulo-2 è presente nel corpo cellulare e negli assoni prossimali dei neuroni di controllo nel pannello C.E la colorazione dalla proteina MAP-2 nel corpo cellulare , e i dendriti nei neuroni trattati con BMP-7 sono nel pannello G.Ecco una serie di gangli cervicali superiori trattati con mezzi di controllo, che hanno rilevato 1.100 proteine.
L'ontologia genica che utilizzava il database panther scoprì che la maggior parte delle proteine erano citoplasmatiche. Tuttavia, c'erano proteine e proteine legate alla membrana alle giunzioni cellulari nel campione. Questa analisi ha anche rivelato che le proteine che sono coinvolte in una vasta gamma di vie di segnalazione neuronale sono state rilevate nel campione.
In conclusione, dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di isolare e coltura i neuroni ganglionali cervicali superiori embrionali del ratto per l'analisi morfologica e proteomica. Questo lavoro è stato finanziato dal fondo di sviluppo della facoltà e dal programma di ricerca estiva al Saint Mary's College of California.
