في هذا البروتوكول الفيديو، ونحن نبين بالتفصيل، نظام ثقافة لزراعة البويضات البقرية. يدعم النظام قابلية البويضات للحياة في الثقافة لمدة تصل إلى خمسة أيام ويسمح بتمايزها. باستخدام هذا النظام culture، يمكن زراعة البويضات التي يتم جمعها من بصيلات النمل الصغيرة، والتي لا تستخدم عادة في البروتوكولات القياسية في المختبر في الإنتاج، لزيادة توافر شعيا القابلة للتخصيب.
ويمكن أن يوفر هذا الاستغلال للاحتياطي الأوسع نطاقا خيارات جديدة من أجل الإنقاذ الجيني للأنواع المهددة بالانقراض، أو للأسرة البقرية، أو السلالات المحلية المعرضة لخطر التآكل الجيني. للبدء، إعداد 15 ملليلتر من الثقافة الأساسية المتوسطة وتكملة ذلك وفقا لاتجاهات المخطوطات. المقبل، وإعداد ثلاثة ملليلتر من عقد المتوسطة عن طريق إضافة خمسة cilostamide micromolar إلى الوسط الثقافة الأساسية وصبه في طبق بيتري 35 ملليمتر.
إعداد متوسط IVCO طويل من خلال استكمال الثقافة الأساسية المتوسطة وفقا لاتجاهات المخطوطات. أضف 200 ميكرولترات من متوسطة IVCO طويلة لكل بئر من 96 لوحة مغلفة بشكل جيد. ثم املأ الحواف الأربعة بالماء المعقم للتعويض عن التبخر والحفاظ على الرطوبة المناسبة أثناء الاستزراع.
احتضان لوحة 96-well والمتوسطة عقد في 38.5 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع أقصى نسبة الرطوبة. اغسل المبيضين أربع مرات في ملح ملحي معقمة، والحفاظ على درجة حرارة 26 درجة مئوية. ثم تُطرّح جميع بصيلات القطر التي يزيد قطرها عن ملليمترين، مع إبرة قياس 18 متصلة بمضخة التطلع.
الدانتيل المبيضين المستنشق في منقار مع المالحة العقيمة الحفاظ على 26 درجة مئوية. ضع مبيض واحد في كل مرة على لوحة تقطيع PTFE معقمة ، واستخدم شفرة جراحية رقم 22 لقطع شرائح من قشرة المبيض التي سمكها من 1.5 إلى 2 ملليمتر ، ومتوازية مع المحور الرئيسي للجهاز. الدانتيل شرائح من قشرة المبيض في طبق بيتري الزجاج المعقم، مع تشريح المتوسطة على لوحة دافئة، في 38.5 درجة مئوية.
الدانتيل شريحة قشرة المبيض واحد في طبق بيتري الزجاج 60 ملليمتر، مع اثنين إلى ثلاثة ملليلتر من M199D تحت مجهر تشريح، حدد الجريبات التي هي بين 5 واثنين ملليمتر. تحديد بصيلات غير الارتلي صحية تحت المجهر ستيريو، من خلال مراقبة المعلمات المورفولوجية، مثل مظهر شفاف ساطع بشكل موحد، الأوعية الدموية واسعة النطاق، وطبقة حبيبات العادية. بينما بصيلات الاترفيك لها مظهر رمادي معتم، والأوعية الدموية سيئة، مع COC الظلام داخل.
تجاهل بصيلات الاترتيك ومعالجة جميع الآخرين. استخدم الشفرة الجراحية لإزالة أنسجة المبيض المحيطة بالجريبات على جانب واحد، حتى يتم كشفها. ثم استخدم إبرة قياس 26 لعمل شق في جدار المسام المكشوفة بعناية ، والتي ستفرج عن المحتوى الجريبي الذي يتكون من COC ، والسوائل الجريبية ، وكتل الخلايا.
تحديد COC وفحصه لتكامل الكامولو، ونهاية pellucida سلامة والتجانس من السيتوبلازم. إذا تم استيفاء هذه المعايير، استلهمي COC مع ماصة P20. الدانتيل COC المعزولة في M199D cilostamide، ومواصلة إجراء العزل لمدة 30 دقيقة.
بعد اختيار COCs، كما هو موضح سابقا، وإعداد 16 قطرات مع 20 ميكرولترات من سيلوستاميد M199D في طبق بيتري 60 ملليمتر، ووضع واحد COC صحية في كل قطرة. استخدم مجهرًا مقلوبًا متصلًا بكاميرا لقياس قطر البويضة، باستثناء زونا بيلوسيدا. مع تصور واضح للبويضة، وجعل اثنين من القياسات عمودي، وضمان أن متوسط من القياسات اثنين ضمن نطاق 100 إلى 110 ميكرومتر.
يمكن أن يكون من الصعب قياس قطر البويضات بدقة ، وذلك بسبب خلايا cumulus المرافقة. COCs التي لها بويضات مع قطر أصغر أو أكبر, أو التي ليس لديها بويضة مدورة, أو تلك مع البويضات التي لا يمكن قياسها, ينبغي أن يتم تجاهلها. نقل COCs المختارة في طبق 35 ملليمتر يحتوي على متوسط M199H، والاحتفاظ بها في الحاضنة في 38.5 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع أقصى نسبة الرطوبة، تأكد من أن الوقت العام للعمل لا يتجاوز ساعتين.
بمجرد الانتهاء من إجراءات الاختيار والجمع ، قم بنقل COC واحد إلى مركز كل بئر من اللوحة التي تم إعدادها مسبقًا. احتضان لوحة لمدة خمسة أيام في 38.5 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع الحد الأقصى للرطوبة، وتحديث المتوسطة كل يومين. لتجديد المتوسطة، استبدال 100 ميكرولترات من المتوسط القديم مع 100 ميكرولترات من الطازجة طويلة IVCO المتوسطة، القيام بذلك تحت المجهر ستيريو لتجنب تحريك COCs.
في نهاية IVCO طويلة، وتحليل مورفولوجيا COCs. إذا كان لديهم استثمار خلية cumulus المدمجة مع عدم وجود علامة على التوسع cumulus، أو انحطاط الخلية، تصنيفها على أنها فئة واحدة. إذا كان COCs لديها استثمار خلية cumulus المدمجة مع عدم وجود علامة على التوسع cumulus أو انحطاط الخلية، ومع تشكيلات تشبه أو أكثر من antrum، تصنيفها على أنها من الفئة الثانية.
الفئة الثالثة COCs، وتظهر عدة طبقات من الخلايا الركامية مع عدم وجود علامة على التوسع cumulus، وبعض الخلايا المصنفة في الطبقة الخارجية من الخلايا الكامولو ولا تشكيل يشبه النوبة. تصنيف COCs على أنها الفئة الرابعة إذا كانت تظهر فقدان وفير من الخلايا الركام تمتد لأكثر من 50٪ من سطح البويضة، فضلا عن علامات انحطاط الخلية ومخلفات الخلية. في النهاية من طويلة IVCO ال فظّة مورفولوجيا من ال COC غيّرت.
وتم تحديد أربع فئات بناء على مظهر الخلايا الرامبلية. وبشكل عام، تم تحليل 74 بويضة في خمس بويضات بيولوجية، منها 9.45٪ تم التخلص منها من التقييم الإضافي. تم الحكم على الطبقات الأولى واثنين وثلاثة بصحة جيدة، في حين أظهرت الفئة الرابعة علامات واضحة على الانحطاط، مثل عدم وجود طبقات كاملة من خلايا الكامولو المحيطة بالبويضات.
تعتبر هذه COCs غير مناسب للخضوع لإجراءات المتلقين في إعداد IVP المحتملة. وأظهر تقييم المرحلة الوَنية في نهاية الـ IVCO الطويلة أن نسبة أعلى بكثير من البويضات ظلت موقوفة في مرحلة غير ناضجة، مع وجود الكروماتين لا يزال مُحاطاً داخل الأصوات العالمية. عندما تم التحقيق في التكثيف الكروماتين داخل الأصوات العالمية كعلامة على اكتساب الكفاءة، لوحظ انتقال تكوين الكروماتين إلى مراحل أكثر تكثيفا، وهي GV اثنين و GV ثلاثة، في 59٪ من البويضات. استأنفت نسبة صغيرة meiosis الوصول إلى metaphase مرحلة واحدة، أو انحطاط.
هذه النتائج تثبت أن ثقافة L-IVCO تدعم صلاحية البويضة، مع منع استئناف meiotic لمدة خمسة أيام. في نهاية IVCO طويلة، يمكن استخدام COCs في إجراءات المصب لإنتاج الجنين في المختبر، أي في مرحلة النضج، والتسميد، وثقافة الجنين. هذه الخطوات ضرورية لتقديم دليل على مفهوم أن البويضة اكتسبت كفاءة تنموية أعلى.
إلى جانب عقد إمكانات زيادة كمية البويضات القابلة للتخصيب ، فإن نظام ثقافة IVCO الطويل هو أداة للعلماء المهتمين بتشريح العمليات الخلوية والجزيئية التي تنظم تشكيل gamete المختصة.
