Bu video protokolünde, sığır yumurtası yetiştirmek için bir kültür sistemini ayrıntılı olarak gösteriyoruz. Sistem beş güne kadar kültürde oositcanlılık destekler ve onların farklılaşması için izin verir. Bu kültür sistemi kullanılarak, normalde üretimde in vitro için standart protokollerde kullanılmayan küçük antral foliküllerden toplanan yumurtalar, döllenebilir gametlerin kullanılabilirliğini artırmak için yetiştirilebilir.
Daha geniş rezerv bu sömürü, tehdit türlerin genetik kurtarma için yeni seçenekler sağlayabilir, sığır ailesinin, ya da genetik erozyon riski yerel ırkların. Başlamak için, temel kültür orta 15 mililitre hazırlamak ve el yazması talimatlara göre tamamlamak. Daha sonra, temel kültür ortamına beş mikromolar silostamid ekleyerek üç mililitre tutma ortamı hazırlayın ve 35 milimetrelik petri kabına dökün.
El yazması talimatlara göre temel kültür ortamını tamamlayarak uzun IVCO ortamı hazırlayın. 96 iyi kaplı plakanın her kuyuya 200 mikrolitre uzunluğunda IVCO orta ekleyin. Daha sonra buharlaşmayı telafi etmek ve kültür sırasında uygun nemi korumak için dört kenarı steril suyla doldurun.
96 kuyulu plakayı ve tutma ortamını 38,5 santigrat derece ve maksimum nem oranıyla %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Yumurtalıkları steril tuzlu da dört kez yıkayın, 26 santigrat derecede muhafaza. Daha sonra çapı iki milimetreden fazla olan tüm folikülleri, bir aspirasyon pompasına bağlı 18 gauge iğneile aspire edin.
Dantel steril salin ile bir beher aspire yumurtalıklar 26 santigrat derece korunur. Steril ptfe kesme tahtası üzerinde bir seferde bir yumurtalık yerleştirin ve 1,5 ila iki milimetre kalınlığında ve organın ana eksenine paralel yumurtalık korteks dilimleri kesmek için cerrahi bir sayı 22 bıçak kullanın. Dantel steril bir cam Petri çanak yumurtalık korteks dilimleri, sıcak bir plaka üzerinde kesme orta ile, 38.5 santigrat derece.
Bir diseksiyon mikroskobu altında M199D 2-3 mililitre ile 60 milimetrecam Petri çanak dantel bir yumurtalık korteks dilim, 5 ve iki milimetre arasında folikülleri seçin. Stereo mikroskop altında sağlıklı atreetik olmayan folikülleri, tek düze parlak yarı saydam görünüm, geniş vaskülarizasyon ve düzenli granülasyon tabakası gibi morfolojik parametreleri gözlemleyerek tanımlayın. Atreetik foliküller gri opak bir görünüme sahip iken, ve kötü vaskülarize, içinde koyu bir COC ile.
Atreetik folikülleri atın ve tüm diğerleri işlemek. Bir tarafta folikül çevreleyen yumurtalık dokusukaldırmak için cerrahi bıçak kullanın, maruz kalana kadar. Sonra dikkatle maruz folikül duvarında bir yarık yapmak için bir 26 gauge iğne kullanın, HANGI COC oluşan foliküler içerik serbest bırakacak, foliküler sıvı, ve hücrelerin kümeleri.
COC'yi tanımlayın ve kümülüs bütünlüğü, zona pellucida bütünlüğü ve sitoplazmanın homojenliği için inceleyin. Bu kriterler yerine getirilirse, COC'yi P20 pipetli aspire edin. M199D simide izole COC dantel, ve izolasyon prosedürü devam 30 dakika.
COC'ları seçtikten sonra, daha önce açıklandığı gibi, 60 milimetrelik Petri kabında 20 mikrolitre M199D silostamid ile 16 damla hazırlayın ve her damlaya sağlıklı bir COC yerleştirin. Zona pellucida hariç, yumurta çapını ölçmek için bir kameraya bağlı ters bir mikroskop kullanın. Yumurtanın net bir görselleştirme ile, iki dik ölçümler yapmak, iki ölçüm ortalama 100 ila 110 mikrometre aralığında olduğundan emin olun.
Eşlik eden kümülüs hücreleri nedeniyle yumurta çapını tam olarak ölçmek zor olabilir. Daha küçük veya daha büyük çapta oositleri olan veya yuvarlak yumurtası olmayan veya ölçülebilir olmayan oositleri olan COC'lar atılmalıdır. Seçilen COC'leri M199H ortamı içeren 35 milimetrelik bir tabağa aktarın ve maksimum nem oranı yla 38,5 santigrat derece ve %5 karbondioksit le kuvözde tutun, toplam çalışma süresinin iki saati geçmediğinden emin olun.
Seçim ve toplama işlemleri tamamlandıktan sonra, önceden hazırlanmış 96 kuyulu plakanın her kuyunun ortasına bir COC aktarın. Plakayı 5 gün boyunca 38,5 santigrat derece ve maksimum nem oranıyla %5 karbondioksitle inkübe edin, ortamı her gün yenileyin. Ortamı yenilemek için, 100 mikrolitre eski orta yı 100 mikrolitre taze uzun IVCO ortamı ile değiştirin, COC'ların hareket etmesini önlemek için bunu stereo mikroskop altında yapın.
Uzun IVCO sonunda, COCs morfolojisi analiz. Kümülüs genişlemesi veya hücre dejenerasyonu belirtisi olmayan kompakt bir kümülüs hücre yatırımı varsa, onları birinci sınıf olarak sınıflandırın. COCs kümülüs genişleme veya hücre dejenerasyonu hiçbir belirti ile kompakt bir kümülüs hücre yatırımı varsa, ve bir veya daha fazla antrum benzeri oluşumları ile, sınıf iki olarak sınıflandırın.
Sınıf üç COCs, kümülüs genişleme belirtisi ile kümülüs hücrelerinin birkaç tabaka göstermek, kümülüs hücrelerinin dış tabakasında bazı disaggregated hücreleri ve hiçbir antrum benzeri oluşumu. Oosit yüzeyinin %50'sinden fazlasını genişleten kümülüs hücrelerinin bol miktarda kaybının yanı sıra hücre dejenerasyonu ve hücre enkazı belirtileri gösteriyorsa, COC'leri sınıf dört olarak sınıflandırın. Uzun IVCO sonunda COC brüt morfolojisi değiştirilir.
Kümülüs hücrelerinin görünümüne göre dört sınıf tespit edildi. Toplamda, beş biyolojik kopyada 74 oosit analiz edildi ve bunların %9,45'i ileri değerlendirmeden çıkarıldı. Birinci, ikinci ve üç sınıflar sağlıklı değerlendirilirken, dördüncü sınıf yumurtaları çevreleyen kümülüs hücrelerinin tam tabakalarının yokluğu gibi açık dejenerasyon belirtileri gösterdi.
Bu COC'lar prospektif bir IVP ortamında aşağı işlemden geçmek için uygun görülmedi. Uzun IVCO sonunda meiyotik aşamada değerlendirilmesi yumurtaların önemli ölçüde daha yüksek bir yüzdesi olgunlaşmamış aşamada tutuklandı kaldı gösterdi, kromatin hala GV içinde kapalı. GV içindeki kromatin yoğuşması yeterlilik kazanımının bir göstergesi olarak incelendiğinde, yumurtaların %59'unda kromatin konfigürasyonunun daha yoğun evrelere , yani GV iki ve GV üçe geçişi gözlendi. Küçük bir yüzdesi metafaz bir aşamaya ulaşan meyozis devam, ya da dejenerasyon.
Bu sonuçlar, L-IVCO kültürünün yumurta canlılığını desteklediğini ve beş gün boyunca meyotik devamı engellediğini göstermektedir. Uzun IVCO sonunda, COCs in vitro embriyo üretiminin downstream prosedürleri kullanılabilir, yani, in vitro maturasyon, döllenme, ve embriyo kültürü. Bu adımlar, yumurtanın daha yüksek bir gelişimsel yeterlilik elde ettiği kavramının kanıtını sağlamak için gereklidir.
Döllenebilir yumurta miktarını artırma potansiyelini elinde tutmanın yanı sıra, uzun IVCO kültür sistemi, yetkin bir gamet oluşumunu düzenleyen hücresel ve moleküler süreçleri incelemek isteyen bilim adamları için bir araçtır.
