En este protocolo de vídeo, demostramos en detalle un sistema de cultivo para el cultivo de ovocitos bovinos. El sistema soporta la viabilidad de los ovocitos en la cultura durante un máximo de cinco días y permite su diferenciación. Usando este sistema de cultivo, los ovocitos recogidos de pequeños folículos antrales, que normalmente no se utilizan en protocolos estándar para in vitro en la producción, pueden ser cultivados para aumentar la disponibilidad de gametos fertilizables.
Esta explotación de la reserva más amplia, puede proporcionar nuevas opciones para el salvamento genético de especies amenazadas, de la familia bovina, o de razas locales en riesgo de erosión genética. Para empezar, preparar 15 mililitros de medio de cultivo básico y complementarlo de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. A continuación, preparar tres mililitros de medio de retención añadiendo cinco cilostamida micromolar al medio de cultivo básico y verter en un plato Petri de 35 milímetros.
Preparar el medio IVCO largo complementando el medio de cultivo básico de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Agregue 200 microlitros de medio IVCO largo a cada pozo de una placa recubierta de 96 bien. A continuación, llene los cuatro bordes con agua estéril para compensar la evaporación y mantener la humedad adecuada durante el cultivo.
Incubar la placa de 96 pozos y el medio de retención a 38,5 grados centígrados y 5% dióxido de carbono con la humedad máxima. Lavar los ovarios cuatro veces en solución salina estéril, mantenida a 26 grados centígrados. A continuación, aspirar todos los folículos de más de dos milímetros de diámetro, con una aguja de calibre 18 conectada a una bomba de aspiración.
Encaje los ovarios aspirados en un vaso de precipitados con solución salina estéril mantenida a 26 grados centígrados. Coloque un ovario a la vez en una tabla de cortar PTFE estéril, y utilice una cuchilla quirúrgica número 22 para cortar rodajas de corteza ovárica que tienen 1,5 a dos milímetros de espesor, y paralelas al eje principal del órgano. Encaje las rodajas de corteza ovárica en un plato de cristal estéril Petri, con medio diseccionante en un plato caliente, a 38,5 grados centígrados.
Encaje una rodaja de corteza ovárica en una placa Petri de vidrio de 60 milímetros, con dos o tres mililitros de M199D bajo un microscopio de disección, seleccione los folículos que están entre 5 y dos milímetros. Identificar los folículos no atrérticos sanos bajo el microscopio estéreo, mediante la observación de parámetros morfológicos, como una apariencia translúcida uniformemente brillante, una vascularización extensa y una capa regular de granulosa. Mientras que los folículos atériticos tienen un aspecto opaco gris, y están mal vascularizados, con un COC oscuro en el interior.
Deseche los folículos atériticos y procese todos los demás. Utilice la cuchilla quirúrgica para extraer el tejido ovárico que rodea el folículo en un lado, hasta que se exponga. Luego use una aguja de calibre 26 para hacer cuidadosamente una hendidura en la pared del folículo expuesta, que liberará el contenido folicular que comprende el COC, el líquido folicular y los grupos de células.
Identificar el COC y examinarlo en busca de integridad cúmulo, integridad de la zona pellucida y homogeneidad del citoplasma. Si se cumplen estos criterios, aspire el COC con una pipeta P20. Encaje el COC aislado en cilostamida M199D y continúe el procedimiento de aislamiento durante 30 minutos.
Después de seleccionar los COC, como se describió anteriormente, prepare 16 gotas con 20 microlitros de cilostamida M199D en una placa Petri de 60 milímetros, y coloque un COC saludable en cada gota. Utilice un microscopio invertido conectado a una cámara para medir el diámetro de los ovocitos, excluyendo la zona pellucida. Con una visualización clara del cito, realice dos mediciones perpendiculares, asegúrese de que la media de las dos mediciones está dentro de un rango de 100 a 110 micrómetros.
Puede ser difícil medir con precisión el diámetro de los ovocitos, debido a las células cúmulos compañeras. Los COC que tienen ovocitos con un diámetro más pequeño o más grande, o que no tienen un ovocitos redondeado, o aquellos con ovocitos que no son medibles, deben descartarse. Transfiera los COC seleccionados a un plato de 35 milímetros que contenga medio M199H, y manténgalos en la incubadora a 38,5 grados centígrados y 5% dióxido de carbono con la humedad máxima, asegúrese de que el tiempo de trabajo general no exceda de dos horas.
Una vez completados los procedimientos de selección y recogida, transfiera un COC al centro de cada pozo de la placa de 96 pozos previamente preparada. Incubar la placa durante cinco días a 38,5 grados centígrados y 5% dióxido de carbono con la humedad máxima, refrescar el medio cada dos días. Para renovar el medio, sustituya 100 microlitros de medio antiguo por 100 microlitros de medio IVCO largo fresco, haga esto bajo el microscopio estéreo para evitar mover los COC.
Al final del IVCO largo, analizar la morfología de los COC. Si tienen una inversión de células cúmulos compactas sin signos de expansión cúmulo, o degeneración celular, clasifique como clase uno. Si los COC tienen una inversión celularcumulus compacta sin signos de expansión cúmulo o degeneración celular, y con una o más formaciones similares a los atramos, clasifiquelas como clase dos.
Clase tres COC, muestran varias capas de células cúmulos sin signo de expansión cúmulo, algunas células desagregadas en la capa externa de las células cúmulos y ninguna formación similar a un antrum. Clasificar los COC como clase cuatro si muestran una pérdida abundante de células cúmulos que se extienden por más del 50% de la superficie de ovocitos, así como signos de degeneración celular y desechos celulares. Al final del IVCO largo se cambia la morfología bruta del COC.
Y cuatro clases fueron identificadas en base a la aparición de las células cúmulos. En total, se analizaron 74 ovocitos en cinco réplicas biológicas, de las cuales el 9,45% fueron descartadas de una evaluación posterior. Las clases uno, dos y tres fueron juzgadas sanas, mientras que la clase cuatro mostró signos claros de degeneración, como la ausencia de capas completas de células cúmulos que rodeaban a los ovocitos.
Estos COC se consideraron inadecuados para someterse a procedimientos posteriores en un entorno de IVP prospectivo. La evaluación de la etapa meítica al final del largo IVCO mostró que un porcentaje significativamente mayor de los ovocitos seguía detenidos en la etapa inmadura, con la cromatina todavía incluida en el GV. Cuando se investigó la condensación de cromatina dentro del GV como un marcador de ganancia de competencia, la transición de la configuración de cromatina a etapas más condensadas, a saber, GV dos y GV tres, se observó en el 59% de los ovocitos. Un pequeño porcentaje reanudó la meiosis alcanzando la metafase una etapa, o degeneración.
Estos resultados demuestran que la cultura L-IVCO apoya la viabilidad de los ovocitos, evitando al mismo tiempo la reanudación meótica durante cinco días. Al final del IVCO largo, los COC pueden utilizarse en procedimientos posteriores de la producción in vitro de embriones, a saber, la maduración in vitro, la fertilización y el cultivo embrionario. Estos pasos son necesarios para proporcionar prueba de concepto de que el ovocitos ha adquirido una mayor competencia de desarrollo.
Además de mantener el potencial de aumentar la cantidad de ovocitos fertilizables, el largo sistema de cultivo IVCO es una herramienta para los científicos que están interesados en diseccionar los procesos celulares y moleculares que regulan la formación de un gameto competente.
