이 비디오 프로토콜에서는 소 난모세포 증가를 위한 문화 시스템인 세부 사항을 자세히 보여줍니다. 이 시스템은 최대 5일 동안 배양물 생존가능성을 지원하며 차별화를 가능하게 합니다. 이러한 배양 시스템을 사용하면 일반적으로 생산 시 체외에서 표준 프로토콜에 사용되지 않는 작은 개소여포에서 채취한 난모세포는 열성 게임의 가용성을 높이기 위해 재배될 수 있다.
더 넓은 예비의이 착취, 위협 종의 유전 구출에 대 한 새로운 옵션을 제공할 수 있습니다., 소 가족의, 또는 유전 침식의 위험에 로컬 품종. 시작하려면 기본 문화 배지의 15 밀리리터를 준비하고 원고 의 지시에 따라 보충하십시오. 다음으로, 기본 배양 배지에 5개의 마이크로몰러 시로스타미드를 추가하여 3밀리리터를 보유하고 35mm 페트리 접시에 붓습니다.
원고 의 방향에 따라 기본 문화 매체를 보충하여 긴 IVCO 매체를 준비하십시오. 96웰 코팅 플레이트의 각 웰에 긴 IVCO 배지 200 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 4개의 가장자리를 멸균물로 채우고 증발을 보정하고 문화 중에 적절한 습도를 유지합니다.
96웰 플레이트와 홀딩 배지를 섭씨 38.5도, 최대 습도가 5%의 이산화탄소로 배양합니다. 난소를 멸균 식염수로 4번 씻고 섭씨 26도에서 유지합니다. 그런 다음 직경이 2밀리미터 이상인 모든 여포를 흡인하고 18 게이지 바늘이 포부 펌프에 연결됩니다.
멸균 식염수로 비커에 흡인 난소를 레이스26°C까지 유지합니다. 멸균 PTFE 도마에 한 번에 하나의 난소를 놓고 수술 번호 22 블레이드를 사용하여 1.5 ~ 2 밀리미터 두께의 난소 피질의 조각을 자르고 장기의 주요 축과 평행합니다. 멸균 유리 페트리 접시에 난소 피질의 조각을 레이스, 따뜻한 접시에 해부 매체와, 섭씨 38.5도에서.
60mm 유리 페트리 접시에 있는 레이스 1 난소 피질 슬라이스, 해부 현미경에서 M199D의 2~3 밀리리터와 함께, 5~2 밀리미터 사이 여포를 선택합니다. 균일하게 밝은 반투명 외관, 광범위한 혈관화 및 일반 과립과층과 같은 형태학적 매개 변수를 관찰하여 스테레오 현미경하에서 건강한 비-atretic 여포를 식별합니다. 폐색 여포는 회색 불투명한 외관을 가지고 있지만, 내부 어두운 COC와 함께, 제대로 혈관이 없습니다.
폐여모를 버리고 다른 모든 것을 처리합니다. 수술 용 블레이드를 사용하여 한쪽에 여포를 둘러싼 난소 조직을 제거하십시오. 그런 다음 26 게이지 바늘을 사용하여 노출된 여포 벽에 슬릿을 조심스럽게 만들어 COC, 여포 액액 및 세포의 덩어리를 포함하는 여포 함량을 방출합니다.
COC를 식별하고 적분 무결성, 조나 펠루시다 무결성 및 세포질의 균질성을 검사합니다. 이러한 기준이 충족되면 P20 파이펫으로 COC를 흡인합니다. M199D 시로사미드에서 격리된 COC를 레이스하고 30분 동안 격리 절차를 계속합니다.
이전에 설명한 대로 COC를 선택한 후 60mm 페트리 접시에 M199D 시로스타미드 20마이크로리터로 16방울을 준비하고 건강한 COC 를 각 방울에 넣습니다. 카메라에 부착된 반전 된 현미경을 사용하여 zona pellucida를 제외한 난소 지름을 측정하십시오. oocyte의 명확한 시각화를 통해 두 개의 수직 측정을 통해 두 측정의 평균이 100~ 110 마이크로미터 범위 내에 있음을 보장합니다.
컴패니언 적혈구로 인해 난모세포의 직경을 정확하게 측정하기가 어려울 수 있다. 직경이 작거나 더 큰 난모세포가 없거나 둥근 난모세포가 없거나 측정할 수 없는 난모세포가 있는 COC를 폐기해야 합니다. 선택한 COC를 M199H 배지가 들어 있는 35mm 접시로 옮기고, 최대 습도가 있는 38.5도 및 이산화탄소 5%의 인큐베이터에 보관하여 전체 근무 시간이 2시간을 초과하지 않도록 하십시오.
선택 및 수집 절차가 완료되면 이전에 준비된 96웰 플레이트의 각 웰의 중심으로 하나의 COC를 전송합니다. 최대 습도가 있는 섭씨 38.5도, 이산화탄소 5%로 5일간 플레이트를 배양하고 격일로 배지를 새로 고칩니다. 배지를 갱신하려면 오래된 배지의 100 마이크로리터를 신선한 긴 IVCO 배지의 100 마이크로리터로 교체하고, 코크스의 이동을 피하기 위해 스테레오 현미경으로 이 작업을 수행합니다.
긴 IVCO의 끝에서, COCs 형태를 분석. 적혈구 확장 또는 세포 변성의 흔적이없는 컴팩트 한 적혈구 세포 투자가있는 경우 클래스 하나로 분류하십시오. COC가 적혈구 팽창 또는 세포 변성의 흔적없이 컴팩트 한 적혈구 투자를 하고 하나 이상의 antrum 과 같은 형성을 가진 경우, 클래스 2로 분류합니다.
클래스 3 COCs, 적운 확장의 흔적없이 적수 세포의 여러 층을 보여, 적운 세포의 외부 층에 일부 분해 된 세포와 아니 antrum 같은 형성. COC를 난구 표면의 50% 이상까지 확장하는 적수 세포의 풍부한 손실뿐만 아니라 세포 변성 및 세포 이물질의 징후를 보이는 경우 4급으로 분류합니다. 긴 IVCO의 끝에서 COC의 총 형태가 변경됩니다.
그리고 4개의 클래스는 적수 세포의 외관에 기초하여 확인되었다. 전반적으로, 5개의 생물학 복제에 있는 74개의 난낭을 분석하였고, 그 중 9.45%는 추가 평가에서 폐기되었습니다. 1, 2, 3등급은 건강한 것으로 판단되었으며, 4등급은 난낭을 둘러싼 적혈구의 완전한 층이 없는 등 변성의 명확한 징후를 보였다.
이러한 COC는 향후 IVP 설정에서 다운스트림 절차를 거치지 않는 것으로 간주되었습니다. 긴 IVCO의 끝에 있는 메이오틱 단계의 평가는 난동세포의 상당히 높은 비율이 미숙한 단계에서 체포된 채로 남아 있는 것을 보여주었으며, 크로마틴은 여전히 GV 내에 동봉되어 있습니다. GV 내의 크로마틴 응축이 능력의 이득의 마커로 조사되었을 때, 크로마틴 구성의 전이보다 응축된 단계, 즉 GV 2 및 GV 3로의 전환은 난모세포의 59%에서 관찰되었다. 작은 백분율은 메타상 1 단계, 또는 변성에 도달 하는 meiosis 를 재개.
이러한 결과는 L-IVCO 배양이 5일 동안 메이오틱 재개를 방지하면서 난소 세포의 생존가능성을 지원한다는 것을 보여줍니다. 긴 IVCO의 끝에서, COC는 체외 배아 생산, 즉 체외 성숙, 수정 및 배아 문화의 다운스트림 절차에 사용될 수 있다. 이러한 단계는 난마세포가 더 높은 발달 능력을 획득했다는 개념 증명을 제공하는 데 필요합니다.
지렬한 난모세포의 양을 증가시키는 잠재력을 보유하는 것 외에도, 긴 IVCO 배양 시스템은 유능한 게임테의 형성을 조절하는 세포 및 분자 공정을 해부하는 데 관심이 있는 과학자들을 위한 도구입니다.
