В этом видео-протоколе мы подробно демонстрируем культурную систему выращивания ооцитов крупного рогатого скота. Система поддерживает жизнеспособность яйцеклеток в культуре на срок до пяти дней и допускает их дифференциацию. Используя эту культурную систему, яйцеклетки, собранные из небольших антрал фолликулов, которые обычно не используются в стандартных протоколах для in vitro в производстве, могут быть выращены, чтобы увеличить доступность оплодотворенных готей.
Такая эксплуатация более широкого заповедника может предоставить новые возможности для генетического спасения видов, на которые угрожает опасность генетической эрозии, или семейство бычьих пород или местных пород. Для начала подготовьте 15 миллилитров базовой культурной среды и дополните ее в соответствии с рукописными указаниями. Затем приготовьте три миллилитров среды, добавив пять микромоляных цилостамида в базовую культурную среду и вылейте его в 35-миллиметровую чашку Петри.
Подготовьтесь к длинной среде IVCO, дополнив базовую культурную среду в соответствии с рукописными указаниями. Добавьте 200 микролитров длинной среды IVCO к каждому колодец 96-хорошо покрытой пластины. Затем заполните четыре края стерильной водой, чтобы компенсировать испарение и поддерживать соответствующую влажность во время культуры.
Инкубировать 96-хорошо пластины и проведения среды при 38,5 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа с максимальной влажностью. Вымойте яичники четыре раза в стерильном солевом растворе, поддерживаемом при 26 градусах по Цельсию. Затем аспирировать все фолликулы, которые более двух миллиметров в диаметре, с 18 калибровочных иглы подключены к аспирации насоса.
Кружева аспирированных яичников в стакане со стерильным солевым раствором поддерживается на 26 градусов по Цельсию. Поместите один яичник одновременно на стерильную разделольную доску PTFE и используйте хирургическое лезвие номер 22, чтобы сократить ломтики коры яичников толщиной от 1,5 до 2 миллиметров и параллельно основной оси органа. Зашнуйте ломтики коры яичников в стерильной стеклянной чашке Петри, с рассечей среды на теплой тарелке, при 38,5 градусах по Цельсию.
Кружева один ломтик коры яичников в 60 миллиметров стекла Петри блюдо, с двумя-тремя миллилитров M199D под микроскопом вскрытия, выберите фолликулы, которые находятся между 5 и 2 миллиметрами. Определите здоровые неатретические фолликулы под стерео микроскопом, наблюдая морфологические параметры, такие как равномерно яркий полупрозрачный вид, обширная васкуляризация и регулярный слой гранулозы. В то время как атретические фолликулы имеют серый непрозрачный вид, и плохо сосудизируется, с темным COC внутри.
Отбросьте атретические фолликулы и обработать все остальные. Используйте хирургическое лезвие, чтобы удалить ткани яичников, окружающих фолликул с одной стороны, пока он не подвергается. Затем используйте 26 калибровочных игл, чтобы тщательно сделать щель в открытой стенке фолликула, который выпустит фолликулярное содержание, состоящее из COC, фолликулярной жидкости и скоплений клеток.
Определите COC и изучить его на целостность cumulus, zona pellucida целостности и однородности цитоплазмы. Если эти критерии будут выполнены, аспирировать COC с P20 пипетки. Кружева изолированных COC в M199D цилостамида, и продолжить процедуру изоляции в течение 30 минут.
После выбора COCs, как описано ранее, подготовить 16 капель с 20 микролитров M199D цилостамида в 60 миллиметров Петри блюдо, и место один здоровый КОК в каждой капле. Используйте перевернутый микроскоп, прикрепленный к камере, чтобы измерить диаметр яйцеклеток, исключая zona pellucida. При четкой визуализации яйцеклетки сделайте два перпендикулярных измерения, убедитесь, что среднее из двух измерений находится в пределах от 100 до 110 микрометров.
Это может быть трудно точно измерить диаметр яйцеклеток, из-за сопутствующих кучевых клеток. COCs, которые имеют ооциты с меньшим или большим диаметром, или которые не имеют округлые яйцеклетки, или те, с яйцеклетки, которые не измеримы, должны быть отброшены. Перенесите выбранные COC в 35-миллиметровую тарелку, содержащую M199H среды, и держать их в инкубаторе на 38,5 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа с максимальной влажностью, убедитесь, что общее рабочее время не превышает двух часов.
Как только процедуры отбора и сбора будут завершены, перенесите один КОК в центр каждой из ранее подготовленных пластин 96-колодец. Инкубировать пластину в течение пяти дней при 38,5 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа с максимальной влажностью, обновлять среды через день. Чтобы обновить носитель, заменить 100 микролитров старой среды на 100 микролитров свежей длинной среды IVCO, сделать это под стерео микроскопом, чтобы избежать перемещения COCs.
В конце длинного IVCO проанализируйте морфологию COCs. Если они имеют компактный cumulus ячейки инвестиций без признаков расширения cumulus, или клеточной дегенерации, классифицировать их как класс один. Если COCs имеют компактный cumulus ячейки инвестиций без признаков расширения cumulus или клеточной дегенерации, и с одним или более antrum-как образований, классифицировать их как класс два.
Класс 3 COCs, показать несколько слоев кучевых клеток без признаков расширения cumulus, некоторые дезагрегированные клетки во внешнем слое кучевых клеток и не antrum-как образование. Классифицировать COCs как класс четыре, если они показывают обильные потери кучевых клеток, простирающихся на более чем 50% поверхности яйцеклетки, а также признаки дегенерации клеток и клеточного мусора. В конце длинного IVCO валовая морфология COC изменена.
И четыре класса были определены на основе появления кучевых клеток. Всего было проанализировано 74 яйцеклетки в пяти биологических репликациях, из которых 9,45% были отброшены от дальнейшей оценки. Классы один, два и три были классифицированы здоровыми, в то время как четвертый класс показал явные признаки дегенерации, такие как отсутствие полных слоев кучевых клеток, окружающих ооциты.
Эти КОК были сочтены непригодными для прохождения процедур ниже по течению в перспективной установке IVP. Оценка мейотической стадии в конце длинного IVCO показала, что значительно более высокий процент яйцеклеток оставался арестованным на незрелой стадии, при этом хроматин все еще заключен в GV. Когда конденсат хроматина в GV исследовался как маркер усиления компетентности, переход хроматиновой конфигурации к более конденсированным стадиям, а именно GV two и GV three, наблюдался в 59% яйцеклеток. Небольшой процент возобновил мейоз достижения метафазы одной стадии, или дегенерации.
Эти результаты показывают, что культура L-IVCO поддерживает жизнеспособность яйцеклеток, предотвращая при этом межиотические возобновления в течение пяти дней. В конце длинного IVCO, COCs могут быть использованы в вниз по течению процедур производства эмбрионов in vitro, а именно, в экстракорпоральном созревании, оплодотворении и культуре эмбрионов. Эти шаги необходимы, чтобы обеспечить доказательство концепции, что яйцеклетки приобрели более высокую компетенцию развития.
Помимо использования потенциала увеличения количества оплодотворенных яйцеклеток, длинная система культуры IVCO является инструментом для ученых, которые заинтересованы в вскрытии клеточных и молекулярных процессов, которые регулируют формирование компетентного геймера.
