このビデオプロトコルでは、ウシの卵母細胞を成長するための培養システムを詳細に示します。このシステムは、培養における卵母細胞の生存率を最大5日間サポートし、その分化を可能にする。この培養系を用いて、生産中のin vitro用の標準プロトコルでは通常使用されない小さな骨包から採取された卵母細胞を、受精可能なアテクトの利用可能性を高めるために成長させることができる。
より広い保護区のこの搾取は、絶滅危惧種、牛科、または遺伝的侵食の危険にさらされている地元の品種の遺伝的救済のための新しいオプションを提供することができます。開始するには, 基本的な培養培地の15ミリリットルを準備し、原稿の指示に従ってそれを補完.次に、塩基性培養培地に5マイクロモルクロスターミドを加えて保持媒体を3ミリリットル調製し、35ミリメートルペトリ皿に注ぎます。
原稿の指示に従って基本的な培養培地を補って長いIVCO培地を準備する。96ウェルコーティングされたプレートの各ウェルに長いIVCO培地の200マイクロリットルを追加します。その後、4つの縁を滅菌水で満たし、蒸発を補い、培養中に適切な湿度を維持します。
96ウェルプレートと保持媒体を摂氏38.5度、最大湿度で5%の二酸化炭素でインキュベートします。卵巣を無菌生理食糸で4回洗浄し、摂氏26度に維持する。その後、直径2ミリメートル以上のすべての卵胞を吸引し、18ゲージの針を吸引ポンプに接続します。
滅菌生理食糸を摂氏26度に維持したビーカーで吸引された卵巣をレースする。無菌PTFEまな板の上に一度に1つの卵巣を置き、外科番号22ブレードを使用して、厚さ1.5〜2ミリメートルの卵巣皮質のスライスを切断し、臓器の長軸に平行に切断する。無菌ガラスペトリ皿に卵巣皮質のスライスをレースし、暖かいプレートにミディアムを38.5度で解剖します。
60ミリメートルガラスペトリ皿に1つの卵巣皮質スライスをレースし、解剖顕微鏡の下でM199Dの2〜3ミリリットルで、5〜2ミリメートルの間にある卵胞を選択します。ステレオ顕微鏡下で健康な非不全卵胞を同定し、均一に明るい半透明な外観、広範な血管形成、および通常の顆粒膜層などの形態学的パラメータを観察することによって。食症卵胞は灰色の不透明な外観を有し、血管化が不十分であり、内部に暗いCOCがある。
食痛卵胞を捨て、他のすべてを処理します。外科用ブレードを使用して、片側の卵胞を取り囲む卵巣組織を、露出するまで除去します。その後、26ゲージの針を使用して、露出した卵胞壁にスリットを慎重に作り、COC、濾胞液、および細胞の塊を含む濾胞含有量を放出します。
COCを特定し、細胞質の凝積完全性、透明帯完全性および均質性について調べてください。これらの基準が満たされている場合は、P20ピペットでCOCを吸引します。分離したCOCをM199Dクロスアミドでレースし、30分間分離手順を継続します。
コマクを選択した後、前述のように、60ミリメートルペトリ皿にM199Dクロスアミドの20マイクロリットルで16滴を調製し、各ドロップに1つの健康なCOCを入れます。透明帯を除く卵母細胞径を測定するには、カメラに取り付けられた反転顕微鏡を使用します。卵母細胞の明確な視覚化を使用して、2つの垂直な測定を行い、2つの測定値の平均が100〜110マイクロメートルの範囲内であることを保証します。
コンパニオン積雲細胞のために、卵母細胞の直径を正確に測定することは困難です。小さい直径または大きな直径の卵母細胞を持つCOCs、または丸みを帯びた卵母細胞を持たないCOCs、または測定できない卵母細胞を持つものは廃棄する必要があります。選択したCOCをM199H培地を含む35ミリメートル皿に移し、最大湿度で摂氏38.5度と5%の二酸化炭素をインキュベーターに入れておき、全体的な作業時間が2時間を超えないようにしてください。
選択および収集のプロシージャが完了したら、前に準備された96ウェルプレートの各ウェルの中心に1つのCOCを移す。プレートを摂氏38.5度で5日間、最大湿度で5%の二酸化炭素をインキュベートし、1日おきに培地をリフレッシュします。培地を更新するには、100マイクロリットルの古い培地を100マイクロリットルの新鮮な長いIVCO培地に置き換え、これをステレオ顕微鏡下で行い、COCsを移動しないようにします。
長いIVCOの終わりに、COCの形態を分析する。積雲膨張や細胞変性の兆候のないコンパクトな積雲セル投資がある場合は、クラス1として分類します。COCが積雲膨張や細胞変性の兆候のないコンパクトな積雲細胞投資を有し、1つ以上のアントラム様形成を有する場合は、それらをクラス2として分類する。
クラス3個のCOCsは、積雲膨張の兆候のない積雲細胞のいくつかの層を示し、積雲細胞の外層に一部の分解細胞およびアントラム様形成を示さない。卵母細胞表面の50%以上に及ぶ積雲細胞の豊富な損失、ならびに細胞変性および細胞デブリの兆候を示す場合は、COCをクラス4として分類する。長いIVCOの終わりにCOCの総形態が変わる。
そして、積雲細胞の外観に基づいて4つのクラスを同定した。全体として、5つの生物学的複製物中の74個の卵母細胞が分析され、そのうち9.45%がさらなる評価から廃棄された。クラス1、2、3は健康と判断され、クラス4は卵母細胞を取り巻く積雲細胞の完全な層がないなど、変性の明確な徴候を示した。
これらのCOCは、将来のIVP設定で下流の手順を受けるには不適当であると考えられていました。長いIVCOの終わりにmeiotic段階の評価は、卵母細胞の有意に高い割合が未熟な段階で逮捕されたままであり、クロマチンは依然としてGV内に封入されていることを示した。GV内のクロマチン縮合を能力のゲインのマーカーとして調べたところ、クロマチン構成をより凝縮された段階、すなわちGV2およびGV3への移行は、卵母細胞の59%で観察された。わずかな割合で、転移1段階、または変性に達する微小症が再開された。
これらの結果は、L-IVCO培養が卵母細胞の生存率を支持し、5日間のmeiotic再開を防ぐことを示した。長いIVCOの終わりに、COCは、体外胚生産、すなわち、体外成熟、受精、および胚培養の下流の手順で使用することができる。これらのステップは、卵母細胞がより高い発達能力を獲得したという概念実証を提供するために必要である。
肥沃な卵母細胞の量を増やす可能性を秘めていることに加えて、長いIVCO培養システムは、有能なスタイ分の形成を調節する細胞および分子プロセスを解剖することに興味を持っている科学者のためのツールです。
