يسمح هذا البروتوكول بتحليل هيكل ثلاثي الأبعاد من الإنسان كبيرة جدا على الماوس الباليه النسيج الدهني المجهري. تسهيل ربط الخلل الوظيفي المرضي مع التغيرات الهيكلية الأنسجة الدهنية. عملية المقاصة هذه بسيطة جداً، ومكيفة بشكل جيد جداً لإزالة الإنسان على الأنسجة الدهنية الدافئة الفئران واستخدام المذيبات أقل سمية مثل الإيثانول أو الساليسيلات الميثيل بالمقارنة مع بروتوكولات واضحة أخرى.
تبدأ من خلال غمر الماوس المحاصي أو الأنسجة الدهنية البيضاء البشرية في ما لا يقل عن 10 ملليلتر من 4٪ الفورمالديهايد السلطة في برنامج تلفزيوني في أنبوب بلاستيكية 15 ملليلتر بشكل تفضيلي تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية. هز الأنسجة على لوحة المتداول في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة قبل نقل الأنبوب إلى لوحة المتداول في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي شطف الأنسجة الدهنية البيضاء الثابتة في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة جميع آثار مثبت ونقل الأنسجة إلى أنبوب 15 ملليلتر تحتوي على 10 ملليلتر من 0.3٪ جليكاين في برنامج تلفزيوني لاحتضان ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على شاكر المدارية في 100 ثورة في الدقيقة الواحدة.
عندما تم إخماد مجموعات الألدهيد الحرة المتبقية ، غمر الأنسجة في أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من 0.2٪ تريتون X-100 في PBS لاحتضان لمدة ساعتين مع اهتزاز في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة علاج الأنسجة مع 10 ملليلتر من 0.2٪ تريتون X-100 و 20٪ DMSO مع اهتزاز في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي تزج الأنسجة في أنبوب بلاستيكية 15 ملليلتر التي تحتوي على 10 ملليلتر من 0.1٪ Tween 20، 0.1٪ تريتون X-100، 0.1٪ deoxycholate و 20٪ DMSO في برنامج تلفزيوني لاحتضان ما لا يقل عن 24 ساعة في 37 درجة مئوية مع اهتزاز.
في نهاية الحضانة، شطف الأنسجة مع 10 ملليلتر من 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني على شاكر المدارية في 100 الثورات في الدقيقة لمدة ساعة واحدة. تليها الغمر في 15 ملليلتر من 0.2٪ تريتون X-100، 10٪ DMSO و 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني لمدة 12 ساعة في 37 درجة مئوية مع اهتزاز. لتلوين الأنسجة الدهنية البيضاء.
نقل الأنسجة إلى 300 ميكرولتررس من 0.2٪ تريتون X-100، 10٪ DMSO و 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني، وتستكمل مع الأجسام المضادة الأولية من الفائدة في أنبوب صغير 1.5 ملليلتر حمايته من الضوء مع رقائق الألومنيوم ووضع الأنبوب في أنبوب فالكون 50 ملليلتر. وضع الأنبوب في شاكر المدارية لمدة يومين حضانة في 37 درجة مئوية مع اهتزاز. في نهاية الحضانة شطف الأنسجة مرتين في 10 ملليلتر من 0.2٪ تريتون X-100، 10٪ DMSO و 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني لمدة خمس ساعات في 37 درجة مئوية مع اهتزاز والحماية من الضوء.
بعد شطف الثانية غسل الأنسجة في 10 ملليلتر من 0.2٪ تريتون X-100 الطازجة، 10٪ DMSO و 3٪ BSA وBBS لمدة 16 إلى 48 ساعة في 37 درجة مئوية مع اهتزاز، ثم نقل الأنسجة إلى أنبوب 1.5 ملليلتر تحتوي على 300 ميكرولترات من 0.2٪ تريتون X-100، 10٪ DMSO و 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني، وتستكمل مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة وحماية أنبوب من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم. بعد حضانة يومين في 37 درجة مئوية على شاكر، وغسل الأنسجة مرتين في 10 ملليلتر من 0.2٪ تريتون X-100، 10٪ DMSO و 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني لمدة خمس ساعات في 37 درجة مئوية مع اهتزاز محمية من الضوء. بعد الغسيل الثاني، شطف الأنسجة في أنبوب يحتوي على 10 ملليلتر من 0.2٪ تريتون X-100 الطازجة، 10٪ DMSO و 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني لمدة 16 إلى 48 ساعة في 37 درجة مئوية مع الهز والحماية الخفيفة.
تليها غسل لمدة ساعتين في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني وحدها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز وحماية خفيفة. للبيض تنظيف الأنسجة الدهنية في نهاية غسل PBS تزج الأنسجة و 10 ملليلتر من سلسلة تركيز الإيثانول تصاعدي إرسال لمدة ساعتين حضانة لكل تركيز في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز محمية من الضوء كما هو مبين. في صباح اليوم التالي تزج الأنسجة في زجاجة 20 ملليلتر مع غطاء من البلاستيك يحتوي على خمسة ملليلترات من الساليسيلات الميثيل في غطاء الدخان.
الأنسجة الدهنية البيضاء لا تزال واضحة للعيان في هذه المرحلة. هز الحاوية يحميها من الضوء في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين على الأقل. يصبح النسيج الدهني الأبيض زرع تماما.
ل3D التصوير confocal من الأنسجة الدهنية البيضاء الملون والمطهر جبل غرفة التصوير المعدنية مجهزة بأسفل زجاجي وفي غطاء الدخان نقل الأنسجة إلى الغرفة. ملء الغرفة مع الساليسيلات الميثيل الطازجة. الانتهاء من mountaging من الغرفة عن طريق إضافة زلة غطاء صغير لتحقيق الاستقرار في الأنسجة وزلة غطاء كبير لإغلاق الغرفة.
ضع الغرفة على مرحلة مجهر مقلوب للتصوير النسيجي في التكبير المنخفض لتوليد بضعة خرائط سنتيمتر مكعب ثلاثي الأبعاد لعينة الأنسجة الدهنية بأكملها. بعد توليد خريطة ثلاثية الأبعاد، استخدم هدف هواء لمسافة 20X يوفر نسبة جيدة بين الدقة والعمق لتحديد عدة مناطق لأخذ عينات الأنسجة عند تكبير أعلى. لتجزئة الخلية تحويل 3D رصة على تنسيق البرنامج لتحرير مساحة الذاكرة.
قبل فتح وحدة الخلية من البرنامج. تغيير إعداد الكشف عن الخلايا إلى تلطيخ غشاء البلازما وتحديد قناة الفلورسنت من علامة تستخدم لتحديد محيط الخلية. ثم قم بإعداد العتبات، وتوفير نطاق من أحجام الخلايا المتوقعة وتشغيل التجزئة.
يمكن ملاحظة آثار المقاصة على الأنسجة الدهنية البيضاء البشرية والفأر بالعين المجردة. كما أن المقاصة يحسن بشكل كبير عمق الصورة للأنسجة التي يمكن الحصول عليها. ويسهل كامل النسيج 3D التصوير و 3D خريطة جيل من التكبير 4X.
كما يتيح رسم الخرائط ثلاثية الأبعاد إمكانية اختيار مناطق مختلفة ذات أهمية يتم الحصول عليها عند التكبير 20X إلى عمق 2 ملليمتر. يمكن تحقيق تلطيخ محدد من قطرات الدهون وdipocytes باستخدام perilipin ومضادة للGL-GLUT4 الأجسام المضادة على التوالي. يمكن الكشف عن الأوعية الدموية باستخدام إما الأجسام المضادة CD31 أو الحقن الوريدي لليكتين DyLight 649 قبل وقت قصير من التضحية.
يمكن تصور الضامة والخلايا التائية باستخدام الأجسام المضادة للـ CD301 فيكويريثرين المضادة والأجسام المضادة المضادة لـ TCR Beta Pacific Blue. يمكن الكشف عن شبكة الأعصاب الطرفية باستخدام الأجسام المضادة المضادة التيروزين هيدروكسيلاس. باستخدام هذه التسميات متوسط حجم وحجم توزيع adipocytes وكثافة شبكة الأوعية الدموية داخل الأنسجة الدهنية يمكن بعد ذلك تحديد.
من الأهمية بمكان متابعة وقت الاحتلال كما هو موضح لأن إعداد العينة الضعيف لن يؤدي إلى جودة صورة جيدة. ويمكن الجمع بين هذا البروتوكول مع نظام التصوير المتقدمة أو يمكن أن يقترن بعد معالجة الصور تحليل مجانية.
