وقد أبرزت الدراسات الحديثة الدور الحاسم من الأوعية الدموية والابتكار متعاطفة في إعادة عرض الأنسجة الدهنية خلال تطوير السمنة. هنا نبرهن على طريقة تعديل مناعية للفلوريس التي تقف بكفاءة الأوعية الدموية والألياف العصبية في الأنسجة الدهنية. نهجنا هو على التوالي إلى الأمام والكفاءة مع عدم وجود تنازلات بشأن الكفاءة الدائمة والجودة.
نحصل على الصور باستخدام المجهر confocal. تسمح لنا الدقة العالية للصور بإعادة بناء شبكات الأوعية الدموية وتحليل خصائصها بدقة. ابدأ هذا الإجراء مع التخدير وfufusion من ستة أسابيع C57 الأسود 6J الفئران الذكور كما هو مفصل في بروتوكول النص.
تشريح القضايا الدهنية الأبيض والبني من الفئران. استخدام مقص لكسر عينات الأنسجة إلى قطع صغيرة من قطعة. نقل قطع صغيرة مع ملاقط معقمة في الأنسجة تضمين الكاسيت مع وضع العلامات المناسبة من عينات الأنسجة على الكاسيت.
اغمر الكاسيتات المضمنة التي تحتوي على عينات من الأنسجة في محلول التثبيت عند أربع درجات مئوية لمدة 24 إلى 48 ساعة. نقل قطع صغيرة تم تعقيمها ملاقط في طبق بيتري. غسل العينات 3 مرات مع فرشاة 1x PBS العازلة في 0.5 ملليلتر في غسل.
الآن قطع عينات الأنسجة الثابتة إلى ما يقرب من اثنين مكعبات ملليمتر مكعب مع مقص تعقيم. بالنسبة إلى permeabalisation، قم بنقل العينات إلى أنبوب 1.5 ملليلتر يحتوي على ملليلتر واحد من 1٪ Triton PBS العازلة وتدوير بلطف الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة في 18 دورة في الدقيقة. بعد ساعة إزالة بعناية 1٪ Triton PBS العازلة عن طريق التطلع غسل العينات ثلاث مرات عن طريق إضافة 1X برنامج تلفزيوني مباشرة في نفس الأنابيب.
خلال كل غسل، عكس الأنابيب عدة مرات. للحجب، أضف 0.5 ملليلتر من عازلة الحجب إلى العينات والحاضنة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين مع دوران لطيف. لإعداد 0.4 ملليلتر من محلول الأجسام المضادة الأولية ، تمييع اثنين من ميكرولترات من Endomusin المضادة واثنين من microliters من الأجسام المضادة مضادة hydroxy hydroxy antisoine حتى 396 ميكرولترات من العازلة الحجب.
دوامة وتدور إلى أسفل لاسترداد حجم. الآن، إزالة بعناية العازلة حظر من قطع الأنسجة. إضافة 100 ميكرولترات من حل الأجسام المضادة الأولية المعدة في الأنابيب واحتضان في أربع درجات celcius بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي، قم بجمع محلول الأجسام المضادة الأساسي بعناية لإعادة استخدامها إذا رغبت في ذلك. اغسل العينات ثلاث مرات مع 1x PBST في 500 لتر صغير لكل غسيل لمدة 30 دقيقة مع دوران لطيف في 18 دورة في الدقيقة. لإعداد حل الأجسام المضادة الثانوية ، تمييع اثنين من microlitres من flouro-flouro مترافق ضد الإله IGG في اثنين من microlitres من flouro-flouro مترافق المضادة المسعورة IGG إلى 396 microliters من العازلة الحجب.
دوامة وتدور لفترة وجيزة لجمع كل السائل. الآن، إزالة المخزن المؤقت الغسيل الأخير من العينات. إضافة 100 ميكرولترات من حل الأجسام المضادة الثانوية في الأنابيب.
احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين مع تناوب لطيف في 18 دورة في الدقيقة. بعد إزالة بعناية حل الأجسام المضادة الثانوية، وغسل العينات ثلاث مرات مع 1X PBST في 500 ميكرولتر لكل غسل لمدة 30 دقيقة لكل مع تناوب لطيف في 18 دورة في الدقيقة. لإزالة البصرية، تزج العينات في ملليلتر واحد من 90٪ غليسيرول والحفاظ على العينات في أربع درجات في الظلام حتى تصبح شفافة.
أضف هنا معزل السيليكون إلى الشريحة لإنشاء بئر للتصوير بحجم الصوت. الحفاظ على ارتفاع السيليكون إلى أو أقل قليلا من ذلك من العينة. نقل العينات بعناية إلى البئر وملئه مع المتوسطة المتصاعدة.
وضع غطاء على السطح وختم أرباع الغطاء مع المتوسطة اللزوجة العالية. دع العلاج المتوسط المتصاعد لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة والظلام. بعد اكتمال العلاج، وختم تماما حواف الغطاء لطول العمر العينة الأمثل.
الحصول على صور Z المكدس مع الهدف 20 مرات من المجهر confocal والبرمجيات المقابلة لها. بدء تشغيل النظام. انقر على علامة التبويب التكوين وتفعيل كل من الليزر الأرجون ون 633 ليزر هي ني.
انقر على الحصول على علامة التبويب. في لوحة خطوط الليزر المرئية، حرك أشرطة التمرير ذات الكثافة المقابلة حتى لاختيار خطوط الليزر لأعلى 488 نانومتر و 633 نانومتر. في البداية يمكن تعيين الشدات إلى 20 إلى 30٪ الآن حدد 488، 561، 633 مرآة dichroic الثلاثي.
قم بتنشيط مضاعفات الصور من خلال النقر على خانات الاختيار النشطة. اختيار الmultiplier واحد للانبعاثات التي تمارسها الليزر 488 نانومتر و 34 photomultiplier لتلك التي من الليزر نانومتر 633. تعيين نطاق الطول الموجي إلى ما بين 500 و 550 نانومتر لمضاعف الصورة واحد.
في 650 إلى 750 نانومتر، لمضاعف الصورة ثلاثة. حدد اللون الزائف الذي سيتم استخدامه لعرض الصورة بالنقر المزدوج فوق المستطيل الملون بجانب كل مضاعف للصور واختيار لون من القائمة المنبثقة. الآن انقر على العيش للتحقق من الصورة في العينات.
استخدم موضع Z ناوب لتحديد مستوى التركيز داخل منطقة XY ذات الاهتمام. ضبط سطوع الصور عن طريق تحويل كثافة الليزر، وكسب الذكية، وأزاحة. لكل قناة من قنوات الفلوريسنس، قم بإجراء هذا التعديل ضمن وضع عرض جدول البحث السريع.
انقر على زر الجدول البحث السريع للدخول في وضع جدول البحث السريع الذي يتم عرض بكسل المشبعة باللون الأزرق للمساعدة في إعداد مستوى السطوع المناسب. انقر مرتين على زر الجدول البحث السريع حتى العودة إلى وضع عرض اللون الزائفة. أثناء المسح الضوئي، قم بتشغيل موضع Z nob عكس اتجاه عقارب الساعة لنقل مستوى التركيز إلى نهاية واحدة من حجم الفائدة.
ثم انقر على رأس السهم نهاية لتعيين المسح الضوئي والموضع. بدوره 000 000 000 000 000 000 000 من عقارب الساعة لنقل الطائرة من التركيز من خلال العينة إلى الطرف الآخر من حجم الفائدة. ثم انقر على رأس السهم البدء لتعيين موضع بدء المسح الضوئي.
اضبط حجم الخطوة Z إلى ثلاثة ميكرونات. تغيير جودة الصورة عن طريق تحديد تنسيق 1024 في 1024، وسرعة 100 هرتز، ومتوسط خط اثنين. حدد بداية لبدء الحصول على صورة المكدس Z للحصول على أقصى إسقاط من كومة الصور المكتسبة، انقر فوق علامة التبويب العملية ثم أداة؛ حدد الإسقاط 3D وأدخل الحد الأقصى في قائمة الأسلوب دون تغييرات على عتبة X وY.Set إلى صفر، انقر فوق تطبيق.
سيتم تكديس الحد الأقصى لشدة حجم Z في صورة 2D التي يتم عرضها. لتحليل الصور 2D عبر برمجيات المصدر المفتوح، افتح الصور المكدسة في البرنامج. ضبط قطر السفينة وكثافتها حتى يمكن اختيار جميع هياكل السفينة بشكل صحيح.
حدد تحليل التشغيل وتصدير البيانات التالية لتوجيهات البرنامج. لتحليل الصور ثلاثية الأبعاد عبر برنامج الترخيص، افتح البيانات الأولية للصور مع البرنامج. ضبط عتبة كثافة وغيرها من المعلمات حتى يتم تقسيم هياكل السفينة في كل طبقة من حجم Z بشكل صحيح.
هيكل هيكلى كومة الصورة المُكوّنة الناتجة للحصول على رسم بياني خاص. تحليل خصائص الشريحة المحددة وتصدير البيانات باتباع إرشادات البرنامج. تم جمع الأنسجة الدهنية البيضاء البيضاء في المنطقة البعيدة ، والمنطقة الوسطى من الأنسجة الدهنية البيضاء تحت الجلد القطنية الظهرية والمنطقة الوسيطة للأنسجة الدهنية البنية داخل الكتف.
بعد تلطيخ جبل كامل ، تم تركيب جذوع الأنسجة وصورت مع المجهر confocal. المزيد من الأوعية الدموية كانت ملطخة بشكل إيجابي. مع الأجسام المضادة Endomusin المضادة في الأنسجة الدهنية البيضاء تحت الجلد الجلسرين، مما يشير إلى أن خطوة المقاصة أمر بالغ الأهمية لتلوين كاملة من الأوعية الدموية.
لتحديد ما إذا كانت الأوعية الدموية والألياف العصبية تحمل أنماط مختلفة بين خلع مع هذه الطريقة، تم تنفيذ تلطيخ الفلورسينس الطائفي في الأنسجة الدهنية مع الأجسام المضادة مع مضادة Endomusin لإظهار الأوعية الدموية ومع مضادة للتيروزين هيدروكسي لاس لإظهار الألياف العصبية. ومن المثير للاهتمام، تظهر النتائج أنها كانت الأوعية الدموية أكثر بكثير من الألياف العصبية في الأنسجة الدهنية البني بالمقارنة مع الأنسجة الدهنية البيضاء. بين الأنسجة الدهنية البيضاء، أظهرت الأنسجة الدهنية البيضاء تحت الجلد كثافة الأوعية الدموية أعلى من الأنسجة الدهنية البيضاء الظهارية.
وتجدر الإشارة إلى أنه في حين توسعت الألياف العصبية بالتوازي مع الأوعية الدموية، إلا أنها لم تظهر توطينًا مشتركًا كبيرًا. ثم تم قياس مساحة السفينة وعدد الوصلات وطول الأنبوب نوعياً مع الطريقة 2D في هذه الأنواع الثلاثة من الأنسجة الدهنية ووجدت نتائج مماثلة. هذه الطريقة بكفاءة cos-dens الأوعية الدموية والألياف العصبية والأنسجة الدهنية.
يبدو وكأنه أداة مفيدة لدراسة التغير الديناميكي في الأنسجة الدهنية أثناء تطور السمنة. قوية الفم hy-de هو سام. يرجى تنفيذ الخطوات P-ifa المعنية في اتصال الجلد أوسع واستنشاق والتعامل مع P-ifa بشكل صحيح لأن أشعة الليزر أصبحت المجهر البؤري بعد تضر العين.
تجنب التعرض للعين إلى الحزم القادمة من الهدف،
