تحسين الشبكات الجينية التركيبية إلى حد كبير باستخدام نظم التعبير الجيني خالية من الخلايا. يصف بروتوكولنا عملية تصنيع مفاعل التدفق الدقيق متعدد الطبقات ويظهر أنه يمكن استخدام مثل هذا الجهاز للتعبير الخالي من الخلايا لفترة طويلة من GFP. إن تعبيرات البروتين الخالية من الخلايا بالاقتران مع مفاعلات التدفق الدقيق الفلورية توفر منصة طلائعية سريعة لتصميم الأجهزة البيولوجية الاصطناعية.
هذا الإعداد بأكمله هو تنوعا للغاية ويمكن تكييفها لايقاط أي التفاعلات الكيميائية أو الكيميائية الحيوية التي تتطلب مستويات عالية من السيطرة. إن ضمان استقرار حل التفاعل الخالي من الخلايا أمر بالغ الأهمية ويصعب تحقيقه. تأكد من التركيز على توفير التبريد الكافي والاستفادة من الأنابيب المحددة في هذا البروتوكول.
يتطلب تصنيع وإعداد المنصة التجريبية اتصال العديد من المكونات الفردية ، وهي عملية يمكن أن يكون من الصعب متابعتها بدون أدوات بصرية. للبدء، اتبع على طول في بروتوكول النص المصاحب لتصنيع الجهاز microfluidic وإعداد التحكم بالهواء المضغوط وتنظيم ضغط التدفق التي سيتم استخدامها للسيطرة على الصمامات الحاسمة لهذا الجهاز. لإعداد التبريد خارج رقاقة، تبدأ عن طريق اللف طول أنابيب PTFE على الوجه البارد لعنصر بلتيير وتأمين لفائف مع الشريط.
تأكد من أن أحد طرفي أنابيب PTFE متصل بخزانات نظام التحكم في ضغط طبقة التدفق وأن الطرف الآخر لا يبرز أكثر من سنتيمتر واحد من سطح بلتيير. بعد ذلك إدراج طول 5-10 سم من أنابيب PEEK في نهاية جاحظ من أنابيب PTFE. تطبيق كمية كافية من المجمع الحراري على الوجه الساخن لعنصر بلتيير ووضعها على لوحة باردة من كتلة المياه.
تأكد من أن الأنابيب، عنصر بلتيير، وكتلة التبريد على اتصال مباشر مع بعضها البعض في جميع الأوقات. بعد ذلك ربط عنصر بلتيير إلى وحدة تحكم درجة الحرارة باستخدام موصل حافلة تسلسلي بحيث يمكن تنظيم الجهد المقدمة إلى بلتيير. ثم، وضع بشكل آمن ثيرمستور على سطح بلتيير وربط إخراجها إلى وحدة تحكم درجة الحرارة.
بعد تشغيل برودة المياه، والتكيف مع الجهد الموردة إلى بلتيير حتى تكون درجة الحرارة مستقرة عند أربع درجات مئوية. لكل قناة تحكم الجهاز microfluidic قطع طول أنابيب القياسية التي هي متر واحد طويل. في نهاية واحدة، إدراج دبوس من 23 مقياس، واحد كعب لور نصف بوصة وفي الطرف الآخر إدراج الصلب المقاوم للصدأ ربط دبوس.
قم بتوصيل كعب Luer بموصل نايلون شائك بطول 3/32 بوصة وأدخل بارب الموصل في طول أنابيب البولي يوريثين. ثم أدخل هذا الأنبوب البولي يوريثين مباشرة في واحد من الصمامات اللولبية. المقبل إرفاق قياس 23 نصف بوصة كعب لور إلى حقنة وإدراج هذا في قطعة طولها ثلاثة إلى أربعة سنتيمترات من أنابيب القياسية.
وضع الطرف المفتوح من هذا الأنابيب في خزان من المياه النقية جدا وملء حقنة مع المياه النقية جدا. ترقيم كل قناة تحكم للجهاز microfluidic كما هو موضح هنا. بالنسبة للقنوات من أربعة إلى 29، ابحث عن الأنابيب المقابلة وأدخل الدبوس المعدني في الطرف المفتوح من الأنابيب المرفقة بالمحاقن.
ثم حقن المياه في أنابيب قناة التحكم حتى نصف طول تم شغلها. المقبل، قطع أنابيب من الحقنة وإدراج دبوس موصل الفولاذ المقاوم للصدأ في ثقب المقابلة للجهاز microfluidic. كرر هذه الخطوة لكافة قنوات التحكم.
الآن، استخدم واجهة التحكم لفتح جميع الصمامات اللولبية. وهذا سوف يضغط على السائل داخل قناة التحكم الأنابيب مما اضطره إلى الجهاز microfluidic وإغلاق جميع الصمامات القائمة على الغشاء داخل الجهاز. لكل من الكواشف غير المكرونة قطع طول متر من أنابيب القياسية لربط منفذ الخزان إلى مداخل الجهاز microfluidic.
اتخاذ أحد طرفي الأنابيب وإدراج هذا في الخزان ضمان أن أنابيب تصل إلى قاعدة الخزان. وينبغي تشديد منفذ أنابيب الخزان بحيث يتحقق ختم محكم. ثم، إدراج دبوس اتصال غير القابل للصدأ في نهاية مفتوحة من الأنابيب.
المقبل، إرفاق 23 قياس نصف بوصة كعب لور إلى نهاية حقنة ملليلتر واحد. إضافة طول قصير من أنابيب القياسية إلى كعب الروتين Luer. وضع نهاية الأنابيب في الحل الكاشف المطلوب وملء حقنة مع الكاشف.
ثم أدخل دبوس موصل الفولاذ المقاوم للصدأ في أنابيب البولي يوريثين المتصلة بالمحاقن وملء الأنابيب مع الكاشف. وعند استخدام أحجام رد فعل صغيرة، فإن الكاشف لن يدخل الخزان، وسيكون الأنبوب نفسه بمثابة الخزان. عند الانتهاء، قم بفصل الحقنة وأدخل دبوس الموصل في إحدى فتحات مدخل طبقة التدفق في الجهاز microfluidic.
ثم تطبيق الضغط على كل من الخزانات باستخدام برنامج منظم الضغط لإجبار الكواشف في الجهاز microfluidic. تأكد من أن برودة المياه وعناصر بلتيير قد تم تشغيلها مع درجة حرارة سطح مجموعة بلتيير إلى أربع درجات مئوية. قم بتركيب إعداد التبريد على مقربة من الجهاز microfluidic قدر الإمكان لتقليل حجم الصوت غير المُبَدَّد بين بلتيير ومدخل الجهاز.
ثم توصيل واحد حقنة ملليلتر واحد إلى 23 قياس نصف بوصة كعب لور مع طول قصير من الأنابيب القياسية تعلق على نهاية. رسم في أن يبرد الكاشف لملء الحقنة. المقبل ربط الأنابيب PEEK إلى حقنة عبر أنابيب الضامة وتطبيق الضغط المستمر على حقنة مما اضطر الكاشف من خلال أنابيب PEEK وإلى أنابيب PTFE.
وأخيراً قطع الأنبوب PEEK من الحقنة وأدخلها مباشرة إلى مدخل قناة التدفق للجهاز microfluidic. عندما يتم تطبيق الضغط، سيتم فرض الكاشف المبرد في الجهاز microfluidic. ضمان جهاز microfluidic آمنة على مرحلة المجهر مع كل التحكم وتدفق أنابيب طبقة المرفقة وإغلاق أي فتحات على الحاضنة.
تعيين المقبل درجة الحرارة المحيطة من الحاضنة إلى 29 درجة مئوية. ثم تأكد من أن نظام التبريد قد تم تشغيله ويتم تعيينه إلى أربع درجات مئوية قبل بدء التجربة. تحقق من أن الضغوط المطبقة على منظم ضغط قناة التدفق تم تعيينها إلى 800 ملليبار وباستخدام البرنامج، قم بتعيين ضغط الإخراج لكل قناة تدفق فردية إلى ما بين 20 و 100 ملليبار.
تحقق من أن الضغوط المطبقة على صمامات اللولبية قناة التحكم هي شريط واحد للقنوات من خلال 8 و 3 بار للقنوات من 9 إلى 29. بعد ذلك، أغلق منفذ الجهاز عن طريق الضغط على القناة 29 وفي نفس الوقت قم بتحجيم قنوات التحكم من خلال ثلاثة و15 إلى 28. ثم depressurize بشكل انتقائي قنوات التحكم في multixer للسماح لمثبط واحد مختارة للتدفق إلى الجهاز.
استخدام المجهر لمراقبة إزالة الهواء والتأكد من أن جميع الكواشف تتدفق بشكل صحيح دون إدخال فقاعات الهواء. باستخدام حزمة البرامج المقدمة، قم بإعداد حقول البيانات المتعلقة بعملية المعايرة كما هو موضح في بروتوكول النص المرفق. تحديد حجم السائل بعد ذلك من كل مفاعل خلال خطوة تدفق واحدة من خلال تنفيذ بروتوكول المعايرة.
اتبع الخطوات التي يقدمها برنامج التحكم لإكمال تحليل تجربة المعايرة وتحديد نسبة التحديث لكل مفاعل حلقي في الجهاز microfluidic. وأخيراً، قم بتعيين القيم المطلوبة للتجربة المطلوبة ضمن واجهة التحكم الظاهرية. قم ببدء تشغيل البروتوكول التجريبي عن طريق الضغط على زر إجراء التجربة في واجهة التحكم.
خلال تجربة المعايرة تمتلئ المفاعلات بفلوروفور الذي يتم تسجيل شدته بعد كل تخفيف. ويكشف الانخفاض في كثافة الفلوريسين لكل تخفيف عن حجم حلقة المفاعل التي تم إزاحتها للعدد المحدد من خطوات التدفق. ويُـبَيَّن أن وحدة التخزين هذه هي نسبة التحديث.
يتم عرض متوسط نسبة التحديث والانحراف المعياري لكل خطوة تخفيف باللون الأحمر. سبعة من ثمانية مفاعلات تظهر سلوك مماثل جدا، ولكن مفاعل واحد يظهر تقلبات بعد دورة التخفيف السابعة. وهذا يبرز الحاجة إلى نسب تحديث فريدة لكل مفاعل من المفاعلات.
وكان النص المطول في المختبر ورد فعل الترجمة المعروضة هنا 30٪ من حجم المفاعل تشريد كل 14.6 دقيقة. مفاعلين من الجهاز microfluidic حيث تستخدم كفراغات. جميع المفاعلات الأخرى تتألف 75 ٪ في النسخ في المختبر وترجمة رد فعل الحل و 25 ٪ إما من المياه النقية جدا أو 2.5 نانوموللار قوالب الحمض النووي الخطي الترميز للتعبير عن بروتين deGFP.
في جميع المفاعلات الأربعة التي أضيفت فيها الحمض النووي، كان هناك تعبير واضح عن deGFP. أحد المفاعلات يعرض إشارة فلورانس أقل. وقد يكون السبب في ذلك هو التفاوت في التدفق الذي يؤدي إلى انخفاض الحمض النووي الذي يدخل المفاعل أو بسبب الاختلافات في أبعاد المفاعل.
بعد 14 ساعة، وشوهدت زيادة مفاجئة في إشارة المفاعلات التي تحتوي على الحمض النووي. يحدث هذا بسبب فقاعة الهواء التي تدخل طبقة تدفق الجهاز microfluidic. عند استئناف التدفق، تعود التجربة إلى كثافتها الفلورية السابقة.
حلول التفاعل خالية من الخلايا عرضة للتدهور مع مرور الوقت ما لم يتم تبريدها بما فيه الكفاية، وجعل عملية التبريد الموصوفة في هذا البروتوكول ذات أهمية حاسمة. نظرا لتعدد استخدام المنصة، يمكن إجراء مجموعة متنوعة من التفاعلات الكيميائية الحيوية والكيميائية بطريقة دقيقة وخاضعة للرقابة. وقد أدى تطبيق مفاعلات التدفق الدقيق إلى تسريع دورات اختبار بناء التصميم المتعاقبة للدوائر الجينية المزدوجة الناشئة عن الممارسات الناشئة.
