ويستخدم البروتوكول المقدم لفحص وتحليل المرشحين النشطين بيولوجياً في المنتجات الطبيعية بشكل صحيح للتحكم في الأغشية الحيوية الفموية. ويمكن أيضا أن تتكيف مع التطبيقات في مجالات البحوث بيو فيلم الأخرى. هذه الطريقة معظم فحص النشا والتحليل تجعل من الممكن لإزالة المكونات النشطة بيولوجيا في وقت واحد.
تسوس الأسنان هو نظام غذائي بيو فيلم مشتقة، وتنتشر للغاية، والأمراض المزمنة. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول على تحديد المنتجات الطبيعية للسيطرة على الأغشية الحيوية وبالتالي، تسوس الأسنان. تبدأ من خلال إعداد المذيبات استخراج مع خليط الهيدرولكوهولي.
يمكنك عينة تركيزات بين 50 و 100 ملليغرام لكل ملليلتر من مذيب استخراج وتنفيذ 15 دقيقة الموجات فوق الصوتية بمساعدة الاستخراج في microtubes. كرر استخراج ثلاث مرات. بعد كل خطوة الاستخراج، الطرد المركزي العينة لإزالة المخلفات الصلبة وإزالة الفائق.
الجمع بين عظمى من كل خطوة استخراج وتصفية لهم. حفظ aliquots للتحليل الكيميائي والباسات الحيوية. للكسر، تمييع عينة استخراج الخام للحصول على محلول 100 مليغرام لكل ملليلتر، وذلك باستخدام مذيب الاستخراج الأولي.
ثم، نقل ملليلتر واحد من هذه العينة إلى خرطوشة استخراج المرحلة الصلبة المسبقة مع غرام واحد من الماص، وسعة ستة ملليلتر. تنفيذ الكسر، باستخدام حوالي ثلاثة وحدات التخزين الميتة من كل استخراج رقم وحدة منطقية، وجمع كسر واحد من قبل تكوين رقم وحدة منطقية. حفظ aliquots للتحليل الكيميائي والباسات الحيوية.
إزالة المذيبات تحت فراغ، وتدفق النيتروجين، أو التجميل، وتسجيل الوزن والعائد. إعادة تشكيل المادة الجافة مع أفضل المذيبات الممكنة. حساب تركيز المذيبات لمحلول المخزون، باستخدام الصيغة في مخطوطة النص.
إعادة تنشيط سلالة الميكروبية من S.mutans UA 159 على أجار الدم، وثقافتها في وسط الثقافة السائلة. تنفيذ تخفيف واحد إلى 20 من الثقافة الأولية باستخدام نفس الوسط الثقافة، واحتضان ذلك حتى تصل إلى منتصف مرحلة النمو سجل. إعداد inoculum مع عدد محدد من السكان في TYEG للمقايس المضادة للميكروبات و TYE مع 1٪ السكروز لمقايسات بيو فيلم.
بالنسبة للنشاط المضاد للميكروبات، حدد تركيز العينة للتحليل، وأضفها إلى طبق 96 بئرًا. قم بتضمين مجموعة من عناصر التحكم في كل لوحة، كما هو موضح في مخطوطة النص. باستخدام TYEG ، ضبط حجم 100 ميكروليتر ، تلقيح 100 ميكرولترات من الثقافة الميكروبية ، واحتضان لوحة لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية في 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون.
تحليل النمو البكتيري وفقا لتكدر عن طريق التفتيش البصري للآبار. تلقيح aliquot من التخفيف المطلوب في لوحات أجار محددة في التكرارات، واحتضان لوحات. بعد الحضانة، أداء تعداد مستعمرة.
وزن حبات هيدروكسيباتيت في الأنابيب الدقيقة وتعقيمها. ثم غسل الخرز، وذلك باستخدام العازلة الامتزاز Ab.Add 500 ميكرولترات من اللعاب في الأنابيب الدقيقة لتشكيل فيلم لعابي، واحتضان في 37 درجة مئوية مع 24 التناوب في الدقيقة لمدة 40 دقيقة. إزالة اللعاب supernatant وغسل الخرز ثلاث مرات مع AB لإعدادها لمجرّنات المصب.
إضافة 500 ميكرولترات من العينة أو التحكم في كل ميكروتيوب تحتوي على حبات مع بلعية اللعابية، واحتضان لهم في 24 دوران في الدقيقة الواحدة و 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. اغسل الخرز ثلاث مرات مع Ab.Add 500 ميكرولترات من الثقافة الميكروبية لكل ميكروتيوب ، واحتضان الأنابيب في ظروف مماثلة لمدة ساعة واحدة. ثم غسل الخلايا غير المنضمة ثلاث مرات مع مخزن اب المؤقت.
Resuspend كل عينة مع ملليلتر واحد من Ab العازلة، وcenticade في سبعة واط لمدة 30 ثانية. تخفيف تسلسلي aliquots من كل تعليق، عشرة أضعاف، وطبق لهم على لوحات أجار محددة. احتضان لوحات لمدة 48 ساعة في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون، وعدد المستعمرات.
لتحليل البيانات، إدخال البيانات الخام لل bioassays في جدول بيانات، وحساب سجل من تثبيط النمو الميكروبي من قبل كل علاج، والنسبة المئوية سجل من مثبطات النمو الميكروبي، مقارنة مع عنصر التحكم. تصحيح الكثافة البصرية للقراءات، وحساب النسبة المئوية لتثبيط الكتلة الحيوية. وتظهر هنا النبذة الكيميائية للفحص البيولوجي لكمية ديتريبين من نوع كليرودان والفلافونويدات الجلايكولا في ثلاثة أصناف من مستخلصات سي.
بعد تحليل البيانات الخام، أظهرت أربعة مقتطفات استجابة إيجابية. تُظهر البيانات الكروماتوغرافية لهذه المقتطفات الأربعة الوجود المتزامن للدايتربينات من نوع كليرودان والفلافونويدات الجليكوسيتلات. وبالإضافة إلى ذلك، فهي تشمل نفس المنطقة الأحيائية والتنوع.
يتم عرض نسبة مئوية من CFU من الخلايا المعالجة planktonic ، والكتلة الحيوية في المئة من الأغشية الحيوية المعالجة ، وCFU في المئة من بيو فيلم المعالجة هنا. لم استخراج الخام أثرت بشكل كبير على إزالة خلايا S.mutans الالتزام ببيليكل اللعابي. أضعفت الالتصاق من S.mutans خلايا إلى المصفوفة جلوكان كان بثلاثة من المقتطفات الخام.
وبما أن كل نوع من النباتات يتطلب أساليب تحليل كيميائية محسنة ومحددة، فيجب اختيار أفضل كسر للمذيبات وطريقة تحليلية من التقارير السابقة أو تحديدها حسب التصميم التجريبي. من المهم إعداد تركيبات مع استخراج الخام الأكثر نشاطا والكسور واختبارها على نماذج معقدة لمنع تطور الأغشية الحيوية وتجاويف.
