Das vorgestellte Protokoll wird zum korrekten Screening und Analysieren von bioaktiven Kandidaten in Naturprodukten zur Kontrolle oraler Biofilme verwendet. Es kann auch für Anwendungen in anderen Biofilmforschungsbereichen angepasst werden. Diese Stärke-Screening- und Analysemethode ermöglicht es, bioaktive Komponenten gleichzeitig zu entfernen.
Zahnkaries ist eine Biofilm-Diät abgeleitet, weit verbreitete, chronische Krankheit. Dieses Protokoll kann helfen, natürliche Produkte zur Kontrolle von Biofilmen und damit zahnärztlichen Karies zu identifizieren. Beginnen Sie mit der Herstellung des Extraktionslösungsmittels mit einem hydroalkoholischen Gemisch.
Sie proben Konzentrationen zwischen 50 und 100 Milligramm pro Milliliter des Extraktionslösungsmittels und führen 15-minütige Ultraschall-unterstützte Extraktionen in Mikroröhren durch. Wiederholen Sie die Extraktion dreimal. Zentrifugieren Sie nach jedem Extraktionsschritt die Probe, um den festen Rückstand zu entwirren und den Überstand zu entfernen.
Kombinieren Sie die Überräube aus jedem Extraktionsschritt und filtern Sie sie. Speichern Sie die Aliquots für chemische Analysen und Bioassays. Zur Fraktionierung die Rohextraktprobe verdünnen, um eine 100 Milligramm pro Milliliter Lösung zu erhalten, mit dem anfänglichen Extraktionslösungsmittel.
Dann übertragen Sie einen Milliliter dieser Probe auf eine vorkonditionierte Festphasen-Extraktionspatrone mit einem Gramm Absorbent und einer Kapazität von sechs Millilitern. Führen Sie die Fraktionierung mit etwa drei toten Volumes jeder Extraktions-LUN durch, und erfassen Sie einen Bruchteil nach LUN-Zusammensetzung. Speichern Sie Aliquots für chemische Analysen und Bioassays.
Entfernen Sie das Lösungsmittel unter Vakuum, Stickstofffluss oder Lyophilisierung, und registrieren Sie Gewicht und Ausbeute. Rekonstituieren Sie die Trockenmasse mit den bestmöglichen Lösungsmitteln. Berechnen Sie die Lösungsmittelkonzentration für die Stammlösung unter Verwendung der Formel im Textmanuskript.
Reaktivieren Sie den mikrobiellen Stamm von S.mutans UA 159 auf Blutagar, und kulturen Sie ihn in flüssigen Kulturmedium. Führen Sie eine Ein- bis 20-Verdünnung der Anfangskultur mit demselben Kulturmedium durch und inkubieren Sie sie, bis sie die Wachstumsphase mit dem mittleren Protokoll erreicht. Bereiten Sie das Inokulum mit einer definierten Population in TYEG auf antimikrobielle Assays und TYE mit 1%Saccharose für Biofilm-Assays vor.
Für antimikrobielle Aktivität, definieren Sie die Konzentration der Probe für die Analyse, und fügen Sie sie zu einer 96-Well-Platte. Fügen Sie eine Reihe von Steuerelementen in jede Platte ein, wie im Textmanuskript beschrieben. Passen Sie mit TYEG das Volumen auf 100 Mikroliter an, impfen Sie 100 Mikroliter mikrobielle Kultur und inkubieren Sie die Platte 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid.
Analysieren Sie das Bakterienwachstum nach Trübung durch visuelle Inspektion der Brunnen. Induplizieren Sie ein Aliquot der gewünschten Verdünnung in bestimmten Agarplatten in Duplikaten und inkubieren Sie die Platten. Führen Sie nach der Inkubation Koloniezählungen durch.
Hydroxyapatitperlen in Mikroröhrchen wiegen und sterilisieren. Dann waschen Sie die Perlen, mit Adsorptionspuffer Ab.Add 500 Mikroliter Speichel in die Mikroröhren, um eine Speichelfolie zu bilden, und inkubieren bei 37 Grad Celsius mit 24 Umdrehungen pro Minute für 40 Minuten. Entfernen Sie den Speichelüberstand und waschen Sie die Perlen dreimal mit Ab, um sie für nachgeschaltete Tests vorzubereiten.
Fügen Sie 500 Mikroliter der Probe oder die Kontrolle in jedes Mikrotube mit Perlen mit Speichelblatt Pellicle, und inkubieren Sie sie bei 24 Umdrehungen pro Minute und 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Waschen Sie die Perlen dreimal mit Ab.Add 500 Mikroliter mikrobielle Kultur zu jedem Mikrorohr, und inkubieren Sie die Rohre unter ähnlichen Bedingungen für eine Stunde. Waschen Sie dann die ungebundenen Zellen dreimal mit Ab-Puffer.
Setzen Sie jede Probe mit einem Milliliter Ab-Puffer aus, und zentrieren Sie sie 30 Sekunden lang bei sieben Watt. Die Aliquots jeder Suspension verdünnen, verzehnfacht und auf bestimmte Agarplatten plattieren. Inkubieren Sie die Platten für 48 Stunden bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid, und zählen Sie die Kolonien.
Geben Sie für die Datenanalyse die Rohdaten für die Bioassays in eine Kalkulationstabelle ein und berechnen Sie das Protokoll der mikrobiellen Wachstumshemmung durch jede Behandlung und den Log-Prozentsatz der mikrobiellen Wachstumshemmung im Vergleich zur Kontrolle. Korrigieren Sie die optische Dichte der Messwerte und berechnen Sie den Prozentsatz der Biomassehemmung. Das chemische Profil des biologischen Screenings für die Menge der Clerodane-Typ Diterpene und glykosylierten Flavonoide in drei Sorten von C.sylvestris Extrakten, nämlich Sylvestris, Zwischen- und Lingua, sind hier dargestellt.
Nach Auswertung der Rohdaten zeigten vier Auszüge eine positive Reaktion. Die chromatographischen Daten dieser vier Extrakte zeigen das gleichzeitige Vorhandensein von Clerodane-Typ Diterpenen und glykosylierten Flavonoiden. Darüber hinaus enthalten sie das gleiche Biom und die gleiche Vielfalt.
Berechnete Prozente der behandelten planktonischen Zellen, Prozent Biomasse der behandelten Biofilme und Prozent KBE des behandelten Biofilms werden hier gezeigt. Kein Rohextrakt beeinträchtigte signifikant die Entfernung von S.mutans Zellen, die an der Speicheldrüsen-Pellicle haften. Die Haftung von S.mutans-Zellen an der Glucan-Matrix wurde durch drei der rohen Extrakte geschwächt.
Da jede Pflanzenart optimierte und spezifische chemische Analysemethoden erfordert, muss die beste Lösungsmittelfraktion und Analysemethode aus früheren Berichten ausgewählt oder versuchsweise definiert werden. Es ist wichtig, Formulierungen mit den aktivsten Rohextrakten und -fraktionen vorzubereiten und an komplexen Modellen zu testen, um die Entwicklung von Biofilmen und Hohlräumen zu verhindern.
