Le protocole présenté est utilisé pour le dépistage et l’analyse appropriés des candidats bioactifs dans les produits naturels pour contrôler les biofilms oraux. Il peut également être adapté pour des applications dans d’autres domaines de recherche de biofilm. Cette méthode de dépistage et d’analyse de la plupart des amidons permet d’éliminer simultanément les composants bioactifs.
Caries dentaires est un régime biofilm dérivé, très répandue, maladie chronique. Ce protocole peut aider à identifier les produits naturels pour contrôler les biofilms et, par conséquent, les caries dentaires. Commencez par préparer le solvant d’extraction avec un mélange hydroalcoolique.
Vous échantillonnez des concentrations comprises entre 50 et 100 milligrammes par millilitre du solvant d’extraction et effectuez des extractions assistées par ultrasons de 15 minutes dans des microtubes. Répétez l’extraction trois fois. Après chaque étape d’extraction, centrifugez l’échantillon pour décapiter les résidus solides et enlever le supernatant.
Combinez les supernatants de chaque étape d’extraction et filtrez-les. Enregistrez les aliquots pour l’analyse chimique et les bioassays. Pour la fractionnement, diluer l’échantillon d’extrait brut pour obtenir une solution de 100 milligrammes par millilitre, à l’aide du solvant d’extraction initial.
Ensuite, transférez un millilitre de cet échantillon à une cartouche d’extraction en phase solide conditionnée avec un gramme d’absorbant et une capacité de six millilitres. Effectuez la fractionnement, en utilisant environ trois volumes morts de chaque extraction LUN, et de recueillir une fraction par composition LUN. Économisez des aliquots pour l’analyse chimique et les bioassays.
Enlevez le solvant sous vide, le flux d’azote ou la lyophilisation, et enregistrez le poids et le rendement. Reconstituer la matière sèche avec les meilleurs solvants possibles. Calculez la concentration de solvants pour la solution de stock, en utilisant la formule dans le manuscrit du texte.
Réactiver la souche microbienne de S.mutans UA 159 sur l’agar sanguin, et la culture dans le milieu de culture liquide. Effectuez une dilution d’un à 20 de la culture initiale à l’aide du même milieu de culture et incubez-la jusqu’à ce qu’elle atteigne la phase de croissance du milieu du rondin. Préparer l’inoculum avec une population définie dans TYEG pour les analyses anti-microbiennes et TYE avec 1% saccharose pour les analyses de biofilm.
Pour l’activité anti-microbienne, définissez la concentration de l’échantillon pour analyse et ajoutez-le à une plaque de 96 puits. Inclure un ensemble de commandes dans chaque plaque, tel que décrit dans le manuscrit du texte. À l’aide du TYEG, réglez le volume à 100 microlitres, inoculez 100 microlitres de culture microbienne et incubez la plaque pendant 24 heures à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone à 5 %.
Analyser la croissance bactérienne en fonction de la turbidité par inspection visuelle des puits. Inoculer un aliquot de la dilution désirée dans des plaques d’agar spécifiques en doublons, et incuber les plaques. Après l’incubation, effectuer le dénombrement des colonies.
Pesez les perles d’hydroxyapatite dans les microtubes et stérilisez-les. Ensuite, lavez les perles, à l’aide de tampon d’adsorption Ab.Ajouter 500 microlitres de salive dans les microtubes pour former un film salivaire, et incuber à 37 degrés Celsius avec 24 rotations par minute pendant 40 minutes. Retirer le surnatant salivaire et laver les perles trois fois avec Ab pour les préparer aux analyses en aval.
Ajouter 500 microlitres de l’échantillon ou le contrôle dans chaque microtube contenant des perles avec pellicle salivaire, et les incuber à 24 rotations par minute et 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Lavez les perles trois fois avec Ab.Add 500 microlitres de culture microbienne à chaque microtube, et incuber les tubes dans des conditions similaires pendant une heure. Ensuite, lavez les cellules non liées trois fois avec ab tampon.
Resuspendez chaque échantillon avec un millilitre de tampon Ab, et centicade à sept watts pendant 30 secondes. Diluer en série les aliquots de chaque suspension, décupler, et les plaquer sur des plaques d’agar spécifiques. Incuber les plaques pendant 48 heures à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5%, et compter les colonies.
Pour l’analyse des données, entrez les données brutes pour les bioassays dans une feuille de calcul, et calculez le journal de l’inhibition de croissance microbienne par chaque traitement, et le pourcentage de journal de l’inhibition de croissance microbienne, par rapport au contrôle. Corrigez la densité optique des lectures et calculez le pourcentage d’inhibition de la biomasse. Le profil chimique du dépistage biologique de la quantité de diterpenes de type Clerodane et de flavonoïdes glycoylés dans trois variétés d’extraits de C.sylvestris, à savoir sylvestris, intermédiaire et lingua, sont présentés ici.
Après analyse des données brutes, quatre extraits ont montré une réponse favorable. Les données chromatographic de ces quatre extraits montrent la présence simultanée des diterpenes clerodane-type et des flavonoïdes glycoylated. En outre, ils comprennent le même biome et la variété.
Le pourcentage calculé de CFU des cellules planctoniques traitées, la biomasse en pourcentage des biofilms traités, et pour cent de CFU du biofilm traité sont montrés ici. Aucun extrait brut n’a affecté de manière significative l’enlèvement des cellules de S.mutans adhéré au pellicle salivaire. L’adhérence des cellules S.mutans à la matrice glucane a été affaiblie par trois des extraits bruts.
Étant donné que chaque espèce végétale nécessite des méthodes d’analyse chimique optimisées et spécifiques, la meilleure fraction de solvant et la meilleure méthode analytique doivent être sélectionnées à partir de rapports antérieurs ou définies par conception expérimentale. Il est essentiel de préparer des formulations avec l’extrait brut le plus actif et les fractions et de les tester sur des modèles complexes pour empêcher le développement de biofilms et de cavités.
