Представленный протокол используется для правильного скрининга и анализа биологически активных кандидатов в натуральных продуктах для контроля пероральных биопленок. Он также может быть адаптирован для применения в других областях биопленки исследований. Этот метод скрининга и анализа крахмала позволяет одновременно удалять биологически активные компоненты.
Стоматологические кариес является биопленки диеты, полученных, весьма распространенным, хроническим заболеванием. Этот протокол может помочь определить натуральные продукты для контроля биопленки и, следовательно, кариеса зубов. Начните с подготовки растворителя экстракции с гидроалкогольной смесью.
Вы образец концентрации между 50 и 100 миллиграммов на миллилитр растворителя экстракции и выполнить 15-минутный ультразвуковой помощи извлечения в микротрубки. Повторите извлечение три раза. После каждого шага извлечения центрифуга образца, чтобы удалить твердые остатки и удалить супернатант.
Объедините супернатанты с каждого шага извлечения и отфильтруйте их. Сохранить aliquots для химического анализа и биоанализа. Для фракциорной, разбавить образец экстракта сырой, чтобы получить 100 миллиграмм на миллилитр раствор, используя первоначальный растворитель экстракции.
Затем перенесите один миллилитр этого образца в предусловный картридж для извлечения твердой фазы с одним граммами абсорбента и емкостью шесть миллилитров. Выполните фракционирование, используя около трех мертвых томов каждой добычи LUN, и соберите одну фракцию по составу LUN. Сохранить aliquots для химического анализа и биоанализа.
Удалите растворитель под вакуумом, поток азота, или лиофилизации, и зарегистрировать вес и урожайность. Восстановить сухое вещество с наилучшими растворителями. Рассчитайте концентрацию растворителя для растворителя, используя формулу в текстовой рукописи.
Реактивировать микробный штамм S.mutans UA 159 на агар крови, и культурировать его в жидкой среде культуры. Выполните разбавление начальной культуры от одного до 20, используя ту же культурную среду, и инкубировать ее до тех пор, пока она не достигнет фазы роста среднего журнала. Подготовка инокулума с определенной популяцией в TYEG для антимикробных анализов и TYE с 1% сахарозы для анализа биопленки.
Для антимикробной активности определите концентрацию образца для анализа и добавьте его в пластину из 96 колодец. Включите набор элементов управления в каждую пластину, как описано в текстовой рукописи. Используя TYEG, отрегулируйте громкость до 100 микролитров, прививайте 100 микролитров микробной культуры и инкубировать пластину в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия в 5%углекислом газе.
Проанализируйте рост бактерий в соответствии с мутностью путем визуального осмотра скважин. Прививать алицитацию желаемого разбавления в конкретных агарных пластинах в дубликатах и инкубировать пластины. После инкубации выполните колонию подсчитывает.
Взвешивайте гидроксиапатитные бусины в микротрубках и стерилизуйте их. Затем мыть бисер, используя adorption буфер Ab.Add 500 микролитров слюны в микротрубки, чтобы сформировать слюнную пленку, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию с 24 оборотов в минуту в течение 40 минут. Удалите супернатант слюны и мыть бисер три раза с Ab, чтобы подготовить их к вниз по течению анализы.
Добавьте 500 микролитров образца или элемент управления в каждую микротрубку, содержащую бисер со слюнным пелликулом, и инкубировать их при 24 вращениях в минуту и 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут. Вымойте бисер три раза с Ab.Add 500 микролитров микробной культуры для каждого микротрубки, и инкубировать трубки в аналогичных условиях в течение одного часа. Затем мыть неограниченные ячейки три раза с Ab буфера.
Resuspend каждый образец с одним миллилитром буфера Ab, и centicade на 7 ваттах на 30 секунд. Серийно разбавляют алициты каждой подвески, десятикратно, и побывляют их на конкретных агарных пластинах. Инкубировать пластины в течение 48 часов при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа, и рассчитывать колоний.
Для анализа данных вввечите необработанные данные для биоанализа в электронную таблицу и вычислите журнал ингибирования роста микробов при каждом лечении, а также процент ингибирования роста микробов по сравнению с контролем. Исправь оптическую плотность показаний и вычислите процент ингибирования биомассы. Здесь показан химический профиль биологического скрининга на количество дитерпенов типа Клеродана и гликозилированных флавоноидов в трех разновидностях экстрактов C.sylvestris, а именно sylvestris, промежуточных и лингва.
После анализа необработанных данных четыре экстракта показали благоприятную реакцию. Хроматографические данные этих четырех экстрактов показывают одновременное присутствие дитерпенов типа Клеродана и гликозилированных флавоноидов. Кроме того, они включают в себя тот же биом и разнообразие.
Здесь показаны рассчитанный процент CFU обработанных планктонных клеток, процент биомассы обработанных биопленок и процент CFU обработанной биопленки. Ни один сырой экстракт существенно не повлиял на удаление клеток S.mutans, придерживающихся слюнного пелликула. Приклеение клеток S.mutans к глюканой матрице было ослаблено тремя грубыми экстрактами.
Поскольку каждый вид растений требует оптимизированных и конкретных методов химического анализа, лучший растворитель фракции и аналитический метод должен быть выбран из предыдущих докладов или определен экспериментальной конструкцией. Крайне важно подготовить формулировки с наиболее активным экстрактом сырой нефти и фракциями и протестировать их на сложных моделях, чтобы предотвратить развитие биопленок и полостей.
