تقنية الصفيف الدقيق النمط الظاهري هو وسيلة فعالة عالية الإنتاجية التي تحدد وظيفيا الأنشطة الأيضية الخلوية استجابة لمجموعة واسعة من الأيض الدخول. يتم قياس الاستخدام في هذه التكنولوجيا في شكل التنفس الخلوي الذي يحدده مقدار تطور اللون الناتج عن تقليل NADH لصبغة الأكسدة القائمة على التترازوليوم. في هذا العمل، سوف نقدم استخدام المقايسات صفيف الفينوتايب الدقيقة في سياق الطحالب الدقيقة باستخدام نموذج الأنواع الكلاميدوموناس راينهارتي.
الهدف من هذه الدراسة هو إنشاء طريقة موثوقة لوصف phenotyping الأيضية من الطحالب الدقيقة التي يمكن استخدامها لتوسيع نماذج شبكة التمثيل الغذائي الطحالب القائمة أو توجيه إعادة بناء نماذج جديدة. يمكن الحصول على سلالة الكلاميدوموناس راينهارتي CC-503 من مركز موارد الكلاميدوموناس في جامعة مينيسوتا في الولايات المتحدة الأمريكية. تنمو الخلايا في الطازجة تريس خلات فوستات فوستات الدهون وسائل الإعلام إلى منتصف مرحلة السجل.
تحقق من الخلايا تحت المجهر للتأكد من أنها في حالة جيدة ودون أي تلوث. تدور أسفل الثقافة في 2000 G-القوة لمدة 10 دقائق. تجاهل supernatant دون إزعاج بيليه.
إعداد وسائل الإعلام الصنبور الطازجة التي تحتوي على 0.1٪ رباعي الزوليوم صبغ البنفسجي D"إضافة مضادات حيوية مختلفة بما في ذلك Timentin، أمبيسلين، وكاناميسين إلى وسائل الإعلام لمنع النمو البكتيري. يجب حذف الوسائط الدهنية وهذه الخطوة من المواد الغذائية ، اعتمادا على كل نوع لوحة. إعادة تعليق بيليه وسائط الصنبور الطازجة إلى تركيز نهائي من 1 مليون خلية لكل ملليلتر.
استخدام لوحات المقايسة صفيف مركب كيميائي، مثل مصادر الكربون، ومصادر النيتروجين، والفوسفور، والكبريت مصادر لوحات، ومصادر النيتروجين الببتيد. تلقيح 100 ميكرولتر كافية من وسائل الإعلام التي تحتوي على الذات في كل بئر من لوحات المقال. تأكد من تكرار المقايسات.
وتجدر الإشارة إلى أنه في هذه المرحلة ، يجب اختبار الخلايا مع تلطيخ سلبي الغرام قبل وبعد الفحص لرصد التلوث البكتيري. أدخل لوحات المقايسة في منطقة المركب الكيميائي في نظام قارئ الألواح الدقيقة. احتضان جميع لوحات في 30 درجة لمدة تصل إلى سبعة أيام، وبرنامج نظام القارئ microplate لقراءة تغيير لون الصبغة كل 15 دقيقة.
وبما أن معظم قارئات الصفائح الدقيقة لا توفر مصدرا للضوء المستمر أثناء الحضانة ، يجب أن تكون الطحالب قادرة على تنفيذ التنفس غير المتغاير. تصدير البيانات الحركية الخام من قارئ microplate كملفات CSV، والتي سيتم استخدامها في وقت لاحق كمدخل لحزمة البرامج microarray النمط الظاهري وبرنامجنا. لإجراء تحليل بيانات microarray النمط الظاهري، استخدم حزمة البرامج Micro Erik OPM من OmniLog التي تعمل ضمن بيئة برامج R.
في استوديو R، واجهة المستخدم الرسومية ل R، قم بتثبيت حزمة OPM وتبعياتها باستخدام الأوامر المفصلة في المخطوطة. انتقل إلى الدليل الذي يحتوي على ملفات CSV من البيانات الحركية واستورد البيانات باستخدام الدالة OPM القراءة. يمكن تجميع البيانات الحركية وتأديبها باستخدام تقدير المعلمة pref.
باستخدام وظيفة XY مؤامرة يسمح للتنفس أو قياسات النمو ليتم تعيينها كدالة من الوقت للوحات 96 بئر المقايسة. يمكن تصور البيانات كخريطة حرارية باستخدام مخطط مستوى الوظيفة للسماح بنظرة عامة مقارنة سريعة للبيانات الحركية. الخطوة التالية هي تحديد ردود الفعل والجينات المرتبطة المستقلبات الجديدة.
في حالة وجود نموذج موجود للطحالب ، يمكن استخدام تحليل البيانات من نظام microarray النمط الظاهري لصقل هذا النموذج. هنا نقدم خط الأنابيب الذي استخدمناه لصقل شبكة التمثيل الغذائي على نطاق الجينوم لنموذج الكلاميدوموناس باستخدام بيانات microarray النمط الظاهري. عندما اختبار مركب جديد إيجابية للاستخدام, يتم تعريف ملامح رد فعل المركب ذات الصلة باستخدام أساس المعرفة الأيضية, توفير أرقام لجنة الانزيم المرتبطة بها.
الخطوة الأولى هي البحث في كيغ وميتاسيكل لتحديد أرقام لجنة الإنزيم ، ECs ، لردود الفعل باستخدام استقلاب وجدت من صفائف المركبات الكيميائية. بعد ذلك، نستخدم أرقام EC المحددة كأساس للبحث في العديد من موارد التعليق التوضيحية المتاحة للطحالب، مثل معهد الجينوم المشترك، وJGI، و Phytozome، والمنشورات التي تمت مراجعتها من قبل الأقران. تتم إضافة ردود الفعل والأيض إلى نموذج شبكة التمثيل الغذائي Chlamydomonas reinhardtii المستندة إلى COBRA ، iRC1080 ، لتوسيع وصقل النموذج.
إذا لم يتم العثور على أدلة وراثية لدعم رقم المفوضية الأوروبية ، يمكن إجراء بحث قائم على ملف تعريف مثل NCBI Position-Specific Iterative ، NCBI PSI-BLAST ، لتحديد الجينات المرشحة المرتبطة برد الفعل. ثم يتم تقييم النتائج يدويا. أولئك الذين يجتازون خطوة QC هذه بقيم E أقل من 0.05 للارتباط بأرقام EC البحث ، يتم إضافتهم بعد ذلك إلى النموذج المتري.
الخطوة الأخيرة من هذا البروتوكول هي تحسين النموذج وتقييم ومقارنة النماذج. استخدم أحدث إصدار COBRA 3.0 من الأدوات ومنصة MATLAB لتنفيذ خطوات تحسين النموذج. بعد تثبيت صندوق أدوات Cobra، يمكنك تنزيل طراز iRC1080.
ثم في MATLAB، أول شيء نفعله هو التنقل إلى المجلد الذي يحتوي على نموذج المرجع، iRC1080. أضف ردود الفعل المحددة مع الجينات المرتبطة بها إلى نموذج التمثيل الغذائي ، مثل iRC1080 ، باستخدام وظائف صندوق أدوات كوبرا. إضافة رد فعل وتغيير الارتباط الجيني.
انتقل إلى الدليل الذي يحتوي على طراز iRC1080 وتنفيذ الأوامر لتحميل الطراز. إعادة تسميته وإضافة رد فعل جديد والجينات المرتبطة بها. في بعض الحالات عندما لا يتم إنتاج المستقلب داخل الخلايا, ولكن يؤخذ من المتوسط, تفاعلات النقل للمييضات الجديدة تحتاج إلى إضافتها إلى النموذج باستخدام وظيفة رد فعل إضافة / تبادل لإدخال أو إخراج المستقلب في الوسط خارج الخلية.
اختبار سلوك النتيجة الجديدة والنموذج ، على سبيل المثال ، iBD1106 ، من خلال إجراء تحليل توازن التدفق ، FBA ، باستخدام وظيفة تحسين نموذج CB في ظل ظروف الضوء والظلام لتحقيق أقصى قدر من الكتلة الحيوية كوظيفة الكائن. من بين أمور أخرى، مخرجات الحل FBA ثلاثة ناقلات تدفق رد الفعل، وأسعار الظل المستقلب، ورد الفعل خفض التكاليف. هنا، يتم تقديم مثال حيث تتم مقارنة نموذج iRC1080 مع نسخته المكررة، iBD1106، من خلال الحصول على أسعار الظل التي تمثل حساسية الوظيفة الموضوعية للكتلة الحيوية للتغيرات والأيضات التي يتم حسابها في كل نموذج.
هنا نعرض respiration XY المؤامرات والمؤامرات مستوى من مصادر الكربون ومصادر النيتروجين لوحات المقايسة لفراغ وCC-503 في لون البط البري والأرجواني، على التوالي. داخل كل بئر، تمثل منحنيات التنفس تحويل الصبغة عن طريق التخفيض كدالة للوقت. تمثل الذروة البارزة في اللوحة A اكتشاف خلات كمصدر الكربون الوحيد من هذه اللوحة ، وهو ما يتفق مع أدب الكلاميدوموناس.
مقارنة عدد الأيضات التي تم تحديدها باستخدام ثلاث طرق مختلفة، iRC1080، وهو نموذج التمثيل الغذائي الكلاميدوموناس منسقة جيدا، والوقت الكروماتوغرافي الغاز من الرحلة GC-TOF، ومقال microarray النمط الظاهري يظهر أن ستة فقط تداخل المستقلب بين المجموعات الثلاث، في حين أن 149 كانت شائعة بين iRC1080 ومجموعة المقايسة الدقيقة النمط الظاهري. وهذا يدل على أنه في حين أن كل تكنولوجيا لديها قوة نحو بحوث التنميط الأيضي، فإن مجموعة المقايسة المجهرية النمط الظاهري يمكن أن تكون مصدرا هاما للمعلومات الأيضية الجديدة. واستخدمت المعلومات التي تم الحصول عليها لتوسيع وتحسين نموذج شبكة التمثيل الغذائي iRC1080.
هنا، نقارن محتوى نموذج iRC1080 والنموذج الموسع iBD1106، بما في ذلك عدد التفاعلات وعدد الأيضات وعدد الجينات. نظهر أن نموذجنا التكرير أضاف أكثر من 254 ردود الفعل على الشبكة الجديدة الناتجة. وتصنف هذه التفاعلات إلى الأحماض الأمينية، ديببتيدات، تريببتيدات وتفاعلات النقل.
تم استخدام الأيضات التي تم تحديدها حديثا لتوسيع شبكة التمثيل الغذائي وصقل نموذج التمثيل الغذائي Chlamydomonas reinhardtii الحالي. يمكن استخدام المقايسات المجهرية النمط الظاهري لتوصيف الأنماط الظاهرية الأيضية للسلالات الموجودة والمعزولة حديثا. وبالإضافة إلى ذلك، فإن البروتوكول الذي استخدمناه في سياق الطحالب الدقيقة يمكن أن يوجه صقل النماذج الأيضية للأنواع الأخرى.
