Die Phänotyp-Mikroarray-Technologie ist eine effektive Hochdurchsatzmethode, die die zellulären Stoffwechselaktivitäten als Reaktion auf eine Vielzahl von Eintrittsmetaboliten funktionell bestimmt. Die Verwendung in dieser Technologie wird in Form der Zellatmung gemessen, die durch die Menge an Farbentwicklung bestimmt wird, die durch die NADH-Reduktion eines Tetrazolium-basierten Redoxfarbstoffs erzeugt wird. In dieser Arbeit werden wir den Einsatz von Phänotyp-Mikroarray-Assays im Kontext von Mikroalgen unter Verwendung der Modellspezies Chlamydomonas reinhardtii vorstellen.
Ziel dieser Studie ist es, eine zuverlässige Methode zur Charakterisierung der metabolischen Phänotypisierung von Mikroalgen zu etablieren, mit der bestehende metabolische Algennetzwerkmodelle erweitert oder die Rekonstruktion neuer Modelle geleitet werden kann. Chlamydomonas reinhardtii Stamm CC-503 kann aus dem Chlamydomonas Resource Center an der University of Minnesota USA bezogen werden. Züchten Sie die Zellen in frischen Tris-Acetatphosphat-Fettmedien bis zur mittleren Log-Phase.
Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie in gutem Zustand und ohne Kontamination sind. Drehen Sie die Kultur bei 2000 G-Kraft für 10 Minuten herunter. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
Bereiten Sie frische Klopfmedien mit 0,1% Tetrazoliumviolettfarbstoff D vor"Fügen Sie den Medien verschiedene Antibiotika wie Timentin, Ampicillin und Kanamycin hinzu, um das Bakterienwachstum zu hemmen. Fettmedien und dieser Schritt sollten je nach Tellertyp von Nährstoffen weggelassen werden. Suspendieren Sie das Pellet und die frischen Klopfmedien auf eine Endkonzentration von 1 Million Zellen pro Milliliter.
Verwenden Sie chemische Verbindungsarray-Assay-Platten, wie Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, Phosphor- und Schwefelquellenplatten und die Peptidstickstoffquellen. Impfen Sie 100 Mikroliter ausreichend an selbsttragenden Medien in jede Vertiefung der Aufsatzplatten. Stellen Sie sicher, dass Sie die Assays duplizieren.
Es sollte beachtet werden, dass in diesem Stadium zellen vor und nach dem Assay mit gramnegativer Färbung getestet werden sollten, um die bakterielle Kontamination zu überwachen. Setzen Sie die Assay-Platten für den Bereich der chemischen Verbindung in das Mikrotiterplatten-Lesesystem ein. Inkubieren Sie alle Platten bei 30 Grad für bis zu sieben Tage und programmieren Sie das Mikroplattenlesesystem so, dass es den Farbstofffarbwechsel alle 15 Minuten ableset.
Da die meisten Mikroplattenleser während der Inkubation keine kontinuierliche Lichtquelle liefern, sollten die Algen in der Lage sein, heterotrophe Atmung durchzuführen. Exportieren Sie die kinetischen Rohdaten aus dem Mikrotiterplattenleser als CSV-Dateien, die anschließend als Eingabe für das Phänotyp-Microarray-Softwarepaket und unsere Software verwendet werden. Um die Phänotyp-Microarray-Datenanalyse durchzuführen, verwenden Sie das OmniLog phenotype micro Erik OPM-Softwarepaket, das in der R-Softwareumgebung ausgeführt wird.
Installieren Sie in R Studio, der grafischen Benutzeroberfläche für R, das OPM-Paket und seine Abhängigkeiten mit den im Manuskript beschriebenen Befehlen. Navigieren Sie zu dem Verzeichnis, das die CSV-Dateien der kinetischen Daten enthält, und importieren Sie die Daten mit der Funktion OPM lesen. Die kinetischen Daten können mithilfe der Pref-Parameterschätzung aggregiert und diskretisiert werden.
Mit dem Funktions-XY-Diagramm können die Atmungs- oder Wachstumsmessungen als Funktion der Zeit für die Assay-96-Well-Platten abgebildet werden. Die Daten können mit Hilfe des Funktionsebenendiagramms als Heatmap visualisiert werden, um einen schnellen vergleichenden Überblick über die kinetischen Daten zu ermöglichen. Der nächste Schritt besteht darin, die Reaktionen und Gene zu identifizieren, die mit den neuen Metaboliten assoziiert sind.
Im Falle des Vorhandenseins eines vorhandenen Modells für die Algen kann die Datenanalyse aus dem Phänotyp-Microarray-System verwendet werden, um dieses Modell zu verfeinern. Hier stellen wir die Pipeline vor, die wir für die Verfeinerung des metabolischen Netzwerks im Genommaßstab für das Chlamydomonas-Modell unter Verwendung von Phänotyp-Microarray-Daten verwendet haben. Wenn eine neue Verbindung positiv auf die Verwendung getestet wird, werden die relevanten Reaktionsprofile der Verbindung anhand der metabolischen Wissensbasis definiert, wobei die zugehörigen Enzymkommissionsnummern angegeben werden.
Der erste Schritt besteht darin, Kegg und MetaCyc zu durchsuchen, um Enzymkommissionsnummern(ECs) nach Reaktionen zu identifizieren, die metabolisierte Wirkstoffe aus den chemischen Verbindungsarrays verwenden. Als nächstes verwenden wir die identifizierten EC-Nummern als Suchbasis in mehreren verfügbaren Algenannotationsressourcen, wie z. B. dem Joint Genome Institute, JGI, Phytozome und Peer-Review-Publikationen. Die Reaktionen und Metaboliten werden dem COBRA-basierten Chlamydomonas reinhardtii-metabolischen Netzwerkmodell iRC1080 hinzugefügt, um das Modell zu erweitern und zu verfeinern.
Wenn keine genetischen Beweise zur Unterstützung der EC-Nummer gefunden werden, kann eine profilbasierte Suche wie NCBI Position-Specific Iterative, NCBI PSI-BLAST, durchgeführt werden, um Kandidatengene zu identifizieren, die mit der Reaktion assoziiert sind. Die Ergebnisse werden dann manuell ausgewertet. Diejenigen, die diesen QC-Schritt mit E-Werten kleiner als 0,05 für die Relevanz für die Such-EC-Nummern bestehen, werden dann dem Metrikmodell hinzugefügt.
Der letzte Schritt dieses Protokolls besteht darin, das Modell zu verfeinern, die Modelle zu bewerten und zu vergleichen. Verwenden Sie die neueste COBRA Toolbox Version 3.0 und die MATLAB-Plattform, um die Schritte zur Modellverfeinerung auszuführen. Nach der Installation der Cobra-Toolbox können Sie das iRC1080-Modell herunterladen.
In MATLAB müssen Sie als Erstes zu dem Ordner navigieren, der das Referenzmodell iRC1080 enthält. Fügen Sie die identifizierten Reaktionen mit ihren zugehörigen Genen mithilfe der Funktionen der Cobra-Toolbox zum Stoffwechselmodell hinzu, z. B. iRC1080. Fügen Sie reaktionen hinzu und ändern Sie die Genassoziation.
Navigieren Sie zu dem Verzeichnis, das das iRC1080-Modell enthält, und führen Sie die Befehle zum Laden des Modells aus. Benennen Sie es um und fügen Sie eine neue Reaktion und das zugehörige Gen hinzu. In einigen Fällen, in denen der Metabolit nicht intrazellulär produziert wird, sondern aus dem Medium entnommen wird, müssen Transportreaktionen für die neuen Metaboliten dem Modell unter Verwendung der Add-/Exchange-Reaktionsfunktion hinzugefügt werden, um den Metaboliten in das extrazelluläre Medium ein- oder auszugeben.
Testen Sie das Verhalten des neuen Ergebnisses und Modells, z. B. iBD1106, indem Sie eine Flussbilanzanalyse, FBA, mit der Funktion CB-Modell unter hell-dunklen Bedingungen optimieren zur Maximierung der Biomasse als Objektfunktion durchführen. Unter anderem gibt die FBA-Lösung drei Vektoren aus, die Reaktionsflüsse, die Metabolitenschattenpreise und die reaktionsreduzierten Kosten. Hier wird ein Beispiel gegeben, bei dem das iRC1080-Modell mit seiner verfeinerten Version, iBD1106, verglichen wird, indem die Schattenpreise ermittelt werden, die die Sensitivität der Biomasse-Zielfunktion gegenüber Veränderungen und Metaboliten darstellen, die in jedem Modell berücksichtigt werden.
Hier zeigen wir Aspirations-XY-Plots und Level-Plots der Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen-Assay-Platten für Blank- und CC-503 in blaugrüner Farbe bzw. violett. Innerhalb jeder Vertiefung stellen Atmungskurven die Farbstoffumwandlung durch Reduktion als Funktion der Zeit dar. Der hervorgehobene Peak in Panel A stellt den Nachweis von Acetat als einzige Kohlenstoffquelle aus dieser Platte dar, was mit der Chlamydomonas-Literatur übereinstimmt.
Der Vergleich der Anzahl der Metaboliten, die mit drei verschiedenen Methoden identifiziert wurden, iRC1080, dem gut kuratierten Chlamydomonas-Stoffwechselmodell, der Gaschromatographie-Flugzeit GC-TOF und dem Phänotyp-Microarray-Essay, zeigt, dass sich nur sechs Metaboliten zwischen den drei Sätzen überschneiden, während 149 zwischen iRC1080 und dem Phänotyp-Microarray-Assay-Set üblich waren. Dies zeigt, dass, während jede Technologie eine Stärke gegenüber der metabolischen Profiling-Forschung hat, das Phänotyp-Microarray-Assay-Set eine bedeutende Quelle für neue metabolische Informationen sein kann. Die gewonnenen Informationen wurden verwendet, um das metabolische Netzwerkmodell iRC1080 zu erweitern und zu verfeinern.
Hier vergleichen wir den Inhalt des iRC1080-Modells und des erweiterten Modells iBD1106, einschließlich der Anzahl der Reaktionen, der Anzahl der Metaboliten und der Anzahl der Gene. Wir zeigen, dass unsere Modellverfeinerung über 254 Reaktionen zum neuen resultierenden Netzwerk hinzugefügt hat. Diese Reaktionen werden in Aminosäuren, Dipeptide, Tripeptide und Transportreaktionen eingeteilt.
Die neu identifizierten Metaboliten wurden für die metabolische Netzwerkerweiterung und Verfeinerung des bestehenden Chlamydomonas reinhardtii-Stoffwechselmodells verwendet. Die Phänotyp-Microarray-Assays können verwendet werden, um metabolische Phänotypen bestehender und neu isolierter Stämme zu charakterisieren. Darüber hinaus kann das Protokoll, das wir im Zusammenhang mit Mikroalgen verwendet haben, die Verfeinerung von Stoffwechselmodellen anderer Spezies leiten.
