Технология фенотипных микромассивов является эффективным высокопроизводимым методом, который функционально определяет клеточную метаболическую активность в ответ на широкий спектр входных метаболитов. Использование в этой технологии измеряется в виде клеточного дыхания, определяемого количеством развития цвета, производимого восстановлением NADH окислительно-восстановительного красителя на основе тетразолия. В данной работе мы представим использование фенотипных микромассивных анализов в контексте микроводорослей с использованием модельных видов Chlamydomonas reinhardtii.
Целью данного исследования является создание надежного метода характеристики метаболического фенотипирования микроводорослей, который может быть использован для расширения существующих моделей метаболической сети водорослей или руководства реконструкцией новых моделей. Штамм Chlamydomonas reinhardtii CC-503 можно получить в ресурсном центре Chlamydomonas при Университете Миннесоты США. Выращивайте клетки в свежих трис-ацетатфосфатных жировых средах до середины фазы.
Проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что они находятся в хорошей форме и без каких-либо загрязнений. Раскрутите культуру с 2000 G-силой в течение 10 минут. Выбросьте супернатант, не нарушая гранулу.
Приготовьте свежие водопроводные среды, содержащие 0,1% тетразолия фиолетового красителя D"Добавьте в жи различные антибиотики, включая тюмантин, ампициллин и канамицин, чтобы ингибировать рост бактерий. Жировые среды и этот этап должны быть исключены из питательных веществ, в зависимости от каждого типа пластины. Повторно суспендировать гранулу и свежую водопроводную мулине до конечной концентрации 1 миллион клеток на миллилитр.
Используйте пластины для анализа химических соединений, такие как источники углерода, источники азота, пластины источников фосфора и серы, а также источники пептидного азота. Прививка 100 микролитров достаточного количества самосодержащихся сред в каждую лунку пластин эссе. Обязательно дублируйте анализы.
Следует отметить, что на этом этапе клетки должны быть проверены с грамотрицательным окрашиванием до и после анализа для мониторинга бактериального загрязнения. Вставьте пластины для анализа области химического соединения в систему считывателя микропластин. Инкубировать все пластины при 30 градусах в течение семи дней и запрограммировать систему считывателя микропластин на считывание изменения цвета красителя каждые 15 минут.
Поскольку большинство считывателей микропластин не обеспечивают источник непрерывного света во время инкубации, водоросли должны быть в состоянии осуществлять гетеротрофное дыхание. Экспортируйте необработанные кинетические данные из считывателя микропластин в виде CSV-файлов, которые впоследствии будут использоваться в качестве входных данных в программный пакет микрочипа фенотипа и наше программное обеспечение. Для проведения анализа данных фенотипа микрочипов используйте программный пакет OmniLog фенотипа микро Erik OPM, который работает в программной среде R.
В R studio, графическом пользовательском интерфейсе для R, установите пакет OPM и его зависимости с помощью команд, подробно описанных в рукописи. Перейдите в каталог, содержащий CSV-файлы кинетических данных, и импортируйте данные с помощью функции read OPM. Кинетические данные могут быть агрегированы и дискретизированы с помощью оценки параметров pref.
Использование графика функции XY позволяет отобразить измерения дыхания или роста как функцию времени для пробирных пластин из 96 скважин. Данные могут быть визуализированы в виде тепловой карты с использованием графика уровня функции, чтобы обеспечить быстрый сравнительный обзор кинетических данных. Следующим шагом является идентификация реакций и генов, связанных с новыми метаболитами.
В случае наличия существующей модели для водорослей, анализ данных из системы микрочипов фенотипа может быть использован для уточнения этой модели. Здесь мы представляем конвейер, который мы использовали для уточнения метаболической сети в масштабе генома для модели Chlamydomonas с использованием данных микрочипов фенотипа. Когда новое соединение дает положительный результат на использование, соответствующие профили реакций соединения определяются с использованием метаболической базы знаний, предоставляя связанные с ферментами номера комиссий.
Первым шагом является поиск Kegg и MetaCyc для определения комиссионных номеров ферментов, ЭК, для реакций с использованием метаболизированных, найденных из массивов химических соединений. Затем мы используем идентифицированные номера EC в качестве основы для поиска в нескольких доступных ресурсах аннотации водорослей, таких как Институт совместного генома, JGI, Phytozome и рецензируемые публикации. Реакции и метаболиты добавляют в модель метаболической сети Chlamydomonas reinhardtii на основе COBRA, iRC1080, для расширения и уточнения модели.
Если генетические доказательства не найдены в поддержку числа ЕС, для идентификации генов-кандидатов, связанных с реакцией, может быть выполнен поиск на основе профиля, такой как NCBI Position-Specific Iterative, NCBI PSI-BLAST. Затем результаты оцениваются вручную. Те, кто проходит этот шаг контроля качества со значениями E менее 0,05 для релевантности поисковым номерам EC, затем добавляются в метрическую модель.
Последним шагом этого протокола является уточнение модели, оценка и сравнение моделей. Используйте последнюю версию набора инструментов COBRA 3.0 и платформу MATLAB для выполнения шагов по уточнению модели. После установки набора инструментов Cobra вы можете загрузить модель iRC1080.
Затем в MATLAB первое, что нужно сделать, это перейти в папку, содержащую эталонную модель, iRC1080. Добавьте идентифицированные реакции с их ассоциированными генами в метаболическую модель, такую как iRC1080, используя функции набора инструментов Cobra. Добавьте реакцию и измените генную ассоциацию.
Перейдите в каталог, содержащий модель iRC1080, и выполните команды для загрузки модели. Переименуйте его и добавьте новую реакцию и связанный с ней ген. В некоторых случаях, когда метаболит не продуцируется внутриклеточным способом, а берется из среды, транспортные реакции для новых метаболитов необходимо добавить к модели с использованием функции реакции добавления/обмена для ввода или вывода метаболита во внеклеточную среду.
Протестируйте поведение нового результата и модели, например, iBD1106, проведя анализ баланса потока, FBA, используя функцию оптимизации CB модели в светлых и темных условиях для максимизации биомассы в качестве объектной функции. Среди прочего, раствор FBA выводит три вектора: потоки реакций, теневые цены метаболитов и затраты на снижение реакции. Здесь приведен пример, в котором модель iRC1080 сравнивается с ее усовершенствованной версией, iBD1106, путем получения теневых цен, которые представляют чувствительность целевой функции биомассы к изменениям и метаболитам, учитываемым в каждой модели.
Здесь мы показываем графики дыхания XY и графики уровней источников углерода и источников азота, анализные пластины для заготовки и CC-503 в цвете чирка и фиолетового цвета соответственно. Внутри каждой скважины кривые дыхания представляют преобразование красителя путем редукции как функции времени. Выделенный пик на панели А представляет собой обнаружение ацетата как единственного источника углерода из этой пластины, что согласуется с литературой Chlamydomonas.
Сравнение количества метаболитов, идентифицированных с использованием трех различных методов: iRC1080, который является хорошо курируемой метаболической моделью Chlamydomonas, временем газовой хроматографии полета GC-TOF и эссе о микрочипе фенотипа показывает, что только шесть метаболитов перекрываются между тремя наборами, в то время как 149 были общими между iRC1080 и набором анализа микрочипов фенотипа. Это показывает, что, хотя каждая технология имеет силу для исследований метаболического профилирования, набор анализов микрочипов фенотипа может быть значительным источником новой метаболической информации. Полученная информация была использована для расширения и уточнения модели метаболической сети iRC1080.
Здесь сравнивается содержание модели iRC1080 и расширенной модели iBD1106, включая количество реакций, количество метаболитов и количество генов. Мы показываем, что наша модель доработки добавила более 254 реакций к новой результивной сети. Эти реакции классифицируются на аминокислоты, дипептиды, трипептиды и реакции переноса.
Вновь выявленные метаболиты использовали для расширения метаболической сети и уточнения существующей метаболической модели Chlamydomonas reinhardtii. Анализы фенотипа микрочипов могут быть использованы для характеристики метаболических фенотипов существующих и вновь выделенных штаммов. Кроме того, протокол, который мы использовали в контексте микроводорослей, может направлять уточнение метаболических моделей других видов.
