表型微阵列技术是一种有效的高通量方法，可在功能上确定细胞代谢活动，以响应于各种进入代谢物。该技术的利用以细胞呼吸的形式进行测量，该形式由基于四唑的氧化还原染料的NADH还原产生的颜色发展量决定。在这项工作中，我们将介绍使用模型物种衣原体reinhardtii在微藻的背景下使用表型微阵列测定。
本研究的目的是建立一种可靠的方法来表征微藻的代谢表型，可用于扩展现有的藻类代谢网络模型或指导新模型的重建。衣原体REhardtii菌株CC-503可以从美国明尼苏达大学的衣原体资源中心获得。在新鲜的Tris-acetate磷酸脂肪培养基中培养细胞至中对数期。
在显微镜下检查细胞，确保它们处于良好状态并且没有任何污染。以2000 G-force旋转培养物10分钟。丢弃上清液而不干扰沉淀。
准备含有0.1%四唑紫染料D的新鲜水龙头培养基"向培养基中添加不同的抗生素，包括Timentin，氨苄西林和卡那霉素，以抑制细菌生长。脂肪培养基和这一步骤应该从营养素中省略，这取决于每种板类型。将沉淀和新鲜水龙头培养基重新悬浮至每毫升100万个细胞的终浓度。
使用化合物阵列测定板，如碳源、氮源、磷源和硫源板，以及肽氮源。将100微升足够的自含培养基接种到论文板的每个孔中。确保重复测定。
应该注意的是，在这个阶段，应在测定之前和之后用革兰氏阴性染色测试细胞，以监测细菌污染。将化合物区域测定板插入酶标仪系统。将所有板在30度下孵育长达7天，并对酶标仪系统进行编程，使其每15分钟读取一次染料颜色变化。
由于大多数酶标仪在孵育过程中不提供连续光源，因此藻类应该能够进行异养呼吸。将微孔板读数仪的原始动力学数据导出为CSV文件，随后将用作表型微阵列软件包和我们软件的输入。要执行表型微阵列数据分析，请使用在 R 软件环境中运行的 OmniLog 表型微 Erik OPM 软件包。
在 R studio（R 的图形用户界面）中，使用手稿中详述的命令安装 OPM 包及其依赖项。导航到包含动力学数据的 CSV 文件的目录，然后使用读取 OPM 函数导入数据。动力学数据可以使用 pref 参数估计进行聚合和离散化。
使用函数XY图允许呼吸或生长测量值作为测定96孔板的时间函数进行映射。数据可以使用函数级图可视化为热图，以便对动力学数据进行快速比较概述。下一步是确定与新代谢物相关的反应和基因。
在存在现有藻类模型的情况下，来自表型微阵列系统的数据分析可用于完善该模型。在这里，我们介绍了使用表型微阵列数据对衣原体模型进行基因组规模代谢网络细化的管道。当新化合物的利用率测试呈阳性时，使用代谢知识基础定义化合物的相关反应谱，提供相关的酶佣金编号。
第一步是搜索Kegg和MetaCyc，以识别酶的委托编号EC，以使用从化合物阵列中发现的代谢反应。接下来，我们使用已识别的EC编号作为多个可用藻类注释资源的搜索基础，例如联合基因组研究所，JGI，Phytozome和同行评审的出版物。将反应和代谢物添加到基于COBRA的衣原体reinhardtii代谢网络模型iRC1080中，以扩展和完善该模型。
如果没有找到支持EC编号的遗传证据，则可以执行基于配置文件的搜索，例如NCBI位置特异性迭代，NCBI PSI-BLAST，以识别与反应相关的候选基因。然后手动评估结果。然后，通过此 QC 步骤且 E 值小于 0.05（与搜索 EC 编号相关）的那些将添加到指标模型中。
此协议的最后一步是优化模型，评估和比较模型。使用最新的 COBRA 工具箱版本 3.0 和 MATLAB 平台执行模型优化步骤。安装眼镜蛇工具箱后，您可以下载 iRC1080 型号。
然后在 MATLAB 中，首先要做的是导航到包含参考模型 iRC1080 的文件夹。使用眼镜蛇工具箱功能将已识别的反应及其相关基因添加到代谢模型中，例如iRC1080。添加反应并改变基因关联。
导航到包含 iRC1080 模型的目录，然后执行命令以加载模型。重命名它并添加新的反应及其相关基因。在某些情况下，当代谢物不是在细胞内产生，而是从培养基中获取时，需要使用添加/交换反应函数将代谢物的转运反应添加到模型中，以将代谢物输入或输出到细胞外培养基中。
测试新结果和模型的行为，例如iBD1106，通过进行通量平衡分析，FBA，使用函数优化CB模型在明暗条件下实现生物量作为对象函数的最大化。其中，FBA解决方案输出三个载体，反应通量，代谢物阴影价格和反应降低成本。这里提供了一个例子，其中iRC1080模型与其改进版本iBD1106进行比较，通过获得代表生物量目标函数对每个模型中变化和代谢物的敏感性的影子价格。
在这里，我们分别显示了蓝绿色和紫色的空白和CC-503的碳源和氮源测定板的呼吸XY图和水平图。在每个孔中，呼吸曲线表示染料通过减少作为时间的函数的转化。图A中突出显示的峰表示检测到醋酸盐作为该板中唯一的碳源，这与衣原体文献一致。
使用三种不同方法鉴定的代谢物数量的比较，iRC1080是精心策划的衣原体代谢模型，气相色谱飞行时间GC-TOF和表型微阵列论文表明，三组之间只有六种代谢物重叠，而iRC1080和表型微阵列测定集之间共有149种。这表明，虽然每种技术在代谢分析研究方面都有优势，但表型微阵列测定集可以成为新代谢信息的重要来源。获得的信息用于扩充和完善代谢网络模型iRC1080。
在这里，我们比较了iRC1080模型和扩展模型iBD1106的内容，包括反应次数、代谢物数量和基因数量。我们表明，我们的模型优化为新结果网络增加了超过254个反应。这些反应分为氨基酸、二肽、三肽和转运反应。
新鉴定的代谢物用于代谢网络扩增和现有衣原体reinhardtii代谢模型的改进。表型微阵列测定可用于表征现有和新分离菌株的代谢表型。此外，我们在微藻的背景下使用的方案可以指导其他物种代谢模型的改进。
