A tecnologia de micro array de fenótipo é um método eficaz de alta produtividade que determina funcionalmente atividades metabólicas celulares em resposta a uma ampla gama de metabólitos de entrada. A utilização nesta tecnologia é medida na forma de respiração celular determinada pela quantidade de desenvolvimento de cores produzida pela redução naDH de um corante de redox à base de tetrazolium. Neste trabalho, introduziremos o uso de ensaios de micro matriz fenótipo no contexto de micro-algas usando espécies modelo Chlamydomonas reinhardtii.
O objetivo deste estudo é estabelecer um método confiável para caracterizar fenotipagem metabólica de microálgas que possam ser usadas para expandir modelos de rede metabólica de algas existentes ou orientar a reconstrução de novos modelos. Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503 pode ser obtido do centro de recursos Chlamydomonas na Universidade de Minnesota EUA. Cresça as células em mídia fresca de gordura fosfato tris-acetato para a fase de registro médio.
Verifique as células sob o microscópio para ter certeza de que elas estão em boa forma e sem contaminação. Desça a cultura em 2000 G-force por 10 minutos. Descarte o supernatante sem perturbar a pelota.
Prepare as mídias de torneira fresca contendo 0,1% de corante violeta tetrazolium D"Adicione diferentes antibióticos, incluindo Timentin, Ampicillin e Kanamycin à mídia para inibir o crescimento bacteriano. A mídia gorda e esta etapa devem ser omitidas de nutrientes, dependendo de cada tipo de placa. Suspenda a pelota e a nova mídia de torneira para uma concentração final de 1 milhão de células por mililitro.
Use placas de ensaio de matriz de compostos químicos, como fontes de carbono, fontes de nitrogênio, placas de fontes de fósforo e enxofre, e as fontes de nitrogênio peptídeo. Inocular 100 microliter adequado de mídia auto-contendo em cada poço das placas de ensaio. Certifique-se de duplicar os ensaios.
Deve-se notar que, nesta fase, as células devem ser testadas com manchas gram-negativas antes e depois do ensaio para monitorar a contaminação bacteriana. Insira as placas de ensaio da área do composto químico no sistema de leitor de microplacas. Incubar todas as placas a 30 graus por até sete dias e programar o sistema de leitor de microplacas para ler a mudança de cor do corante a cada 15 minutos.
Como a maioria dos leitores de microplaca não fornece uma fonte de luz contínua durante a incubação, as algas devem ser capazes de realizar respiração heterotrófica. Exporte os dados cinéticos brutos do leitor de microplacravuras como arquivos CSV, que posteriormente serão usados como entrada para o pacote de software de microarray fenótipo e nosso software. Para realizar a análise de dados de microarray do fenótipo, use o pacote de software micro Erik OPM do fenótipo OmniLog que é executado dentro do ambiente de software R.
No estúdio R, a interface gráfica do usuário para R, instale o pacote OPM e suas dependências usando os comandos detalhados no manuscrito. Navegue até o diretório que contém os arquivos CSV dos dados cinéticos e importe os dados usando a função OPM de leitura. Os dados cinéticos podem ser agregados e discretizados usando estimativa de parâmetros pref.
O uso da função XY plot permite que as medidas de respiração ou crescimento sejam mapeadas em função do tempo para as placas de 96 poços do ensaio. Os dados podem ser visualizados como um mapa de calor usando o gráfico de nível de função para permitir uma visão geral comparativa rápida dos dados cinéticos. O próximo passo é identificar as reações e genes associados aos novos metabólitos.
No caso da presença de um modelo existente para as algas, a análise de dados do sistema de microarraia fenótipo pode ser usada para refinar este modelo. Aqui apresentamos o pipeline que usamos para o refinamento da rede metabólica em escala de genoma para o modelo Clalamydomonas usando dados de microarray fenótipo. Quando um novo teste composto positivo para utilização, os perfis de reação relevantes do composto são definidos usando base de conhecimento metabólico, fornecendo os números de comissão de enzimas associados.
O primeiro passo é procurar Kegg e MetaCyc para identificar números de comissão de enzimas, CES, para reações usando metabolizados encontrados a partir das matrizes de compostos químicos. Em seguida, usamos os números de CE identificados como base de pesquisa em múltiplos recursos de anotação de algas disponíveis, como o Joint genome Institute, JGI, Phytozome e publicações revisadas por pares. As reações e metabólitos são adicionados ao modelo de rede metabólica Chlamydomonas reinhardtii baseado em COBRA, iRC1080, para expandir e refinar o modelo.
Se não forem encontradas evidências genéticas em apoio ao número ce, uma pesquisa baseada em perfil, como o Iterativo Específico da Posição NCBI, NCBI PSI-BLAST, pode ser realizada para identificar genes candidatos associados à reação. Os resultados são então avaliados manualmente. Aqueles que passarem esta etapa QC com valores E inferiores a 0,05 por relevância para os números de EC de pesquisa, são então adicionados ao modelo métrico.
A última etapa deste protocolo é refinar o modelo, avaliar e comparar os modelos. Use a mais recente caixa de ferramentas COBRA versão 3.0 e a plataforma MATLAB para realizar as etapas para o refinamento do modelo. Depois de instalar a caixa de ferramentas Cobra, você pode baixar o modelo iRC1080.
Em seguida, no MATLAB, a primeira coisa a fazer é navegar até a pasta que contém o modelo de referência, iRC1080. Adicione as reações identificadas com seus genes associados ao modelo metabólico, como o iRC1080, usando as funções da caixa de ferramentas Cobra. Adicione reação e mude a associação genética.
Navegue até o diretório que contém o modelo iRC1080 e execute os comandos para carregar o modelo. Renomeie-o e adicione uma nova reação e seu gene associado. Em alguns casos, quando o metabólito não é produzido intracelularmente, mas é retirado do meio, as reações de transporte para os novos metabólitos precisam ser adicionadas ao modelo usando a função de reação de adicionar/troca para inserir ou saída do metabólito para o meio extracelular.
Teste o comportamento do novo resultado e modelo, por exemplo, iBD1106, realizando análise de equilíbrio de fluxo, FBA, utilizando a função otimizar o modelo cb em condições claras e escuras para a maximização da biomassa como função do objeto. Entre outros, a solução FBA produz três vetores os fluxos de reação, os preços da sombra metabólica e a reação reduziram os custos. Aqui, um exemplo é fornecido onde o modelo iRC1080 é comparado com sua versão refinada, iBD1106, obtendo os preços de sombra que representam a sensibilidade da função objetiva de biomassa para mudanças e metabólitos contabilizados em cada modelo.
Aqui mostramos parcelas de respiração XY e parcelas de nível das fontes de carbono e fontes de nitrogênio assar placas para branco e CC-503 em cor teal e roxo, respectivamente. Dentro de cada poço, as curvas respiratórias representam a conversão de corante por redução em função do tempo. O pico destacado no painel A representa a detecção de acetato como a única fonte de carbono desta placa, que é consistente com a literatura de Clamídias.
A comparação do número de metabólitos identificados utilizando três métodos diferentes, o iRC1080, que é o modelo metabólico clamídomonas bem curado, o tempo de cromatografia gasosa do voo GC-TOF, e o ensaio de microarraia do fenótipo mostram que apenas seis sobreposições metabólicas entre os três conjuntos, enquanto 149 eram comuns entre iRC1080 e o microarrato de fenótipo. Isso mostra que, embora cada tecnologia tenha uma força para a pesquisa de perfil metabólico, o conjunto de ensaios de microarray de fenótipo pode ser uma fonte significativa de novas informações metabólicas. As informações obtidas foram utilizadas para expandir e refinar o modelo de rede metabólica iRC1080.
Aqui, comparamos o conteúdo do modelo iRC1080 e do modelo expandido iBD1106, incluindo o número de reações, número de metabólitos e número de genes. Mostramos que nosso modelo de refinação adicionou mais de 254 reações à nova rede resultante. Essas reações são classificadas em aminoácidos, dipeptídeos, tripeptídeos e reações de transporte.
Os metabólitos recém-identificados foram utilizados para expansão da rede metabólica e refinamento do modelo metabólico chlamydomonas reinhardtii existente. Os ensaios de microarraia fenótipo podem ser usados para caracterizar fenótipos metabólicos de cepas existentes e recém-isoladas. Além disso, o protocolo que utilizamos no contexto das microálgas pode orientar o refinamento de modelos metabólicos de outras espécies.
