La tecnologia phenotype micro-array è un metodo efficace ad alto rendimento che determina funzionalmente le attività metaboliche cellulari in risposta a una vasta gamma di metaboliti di ingresso. L'utilizzo in questa tecnologia è misurato sotto forma di respirazione cellulare determinata dalla quantità di sviluppo del colore prodotta dalla riduzione del NADH di un colorante redox a base di tetrazolio. In questo lavoro, introdurremo l'uso di saggi di micro array fenotipici nel contesto di microalghe utilizzando specie modello Chlamydomonas reinhardtii.
L'obiettivo di questo studio è quello di stabilire un metodo affidabile per caratterizzare la fenotipizzazione metabolica delle microalghe che può essere utilizzato per espandere i modelli di rete metabolica algale esistenti o guidare la ricostruzione di nuovi modelli. Chlamydomonas reinhardtii ceppo CC-503 può essere ottenuto dal centro risorse Chlamydomonas presso l'Università del Minnesota USA. Far crescere le cellule in mezzi grassi freschi di Tris-acetato fosfato fino alla fase intermedia.
Controllare le cellule al microscopio per assicurarsi che siano in buone condizioni e senza alcuna contaminazione. Ruotare la cultura a 2000 G-force per 10 minuti. Scartare il surnatante senza disturbare il pellet.
Preparare un mezzo di rubinetto fresco contenente lo 0,1% di colorante viola tetrazolio D"Aggiungi diversi antibiotici tra cui Timentin, Ampicillina e Kanamicina ai mezzi per inibire la crescita batterica. I mezzi grassi e questo passaggio dovrebbero essere omessi dai nutrienti, a seconda di ciascun tipo di piastra. Sospendere nuovamente il pellet e il mezzo di rubinetto fresco a una concentrazione finale di 1 milione di celle per millilitro.
Utilizzare piastre di analisi di array di composti chimici, come fonti di carbonio, fonti di azoto, piastre di fosforo e zolfo e fonti di azoto peptidico. Inoculare 100 microlitri adeguati di supporti autocontenenti in ciascun pozzo delle tavole del saggio. Assicurati di duplicare i test.
Va notato che in questa fase, le cellule dovrebbero essere testate con colorazione gram-negativa prima e dopo il test per monitorare la contaminazione batterica. Inserire le piastre di analisi dell'area del composto chimico nel sistema di lettura delle micropiasche. Incubare tutte le piastre a 30 gradi per un massimo di sette giorni e programmare il sistema di lettura delle micropiasche per leggere il cambio di colore del colorante ogni 15 minuti.
Poiché la maggior parte dei lettori di micropiasche non fornisce una fonte di luce continua durante l'incubazione, le alghe dovrebbero essere in grado di effettuare la respirazione eterotrofica. Esporta i dati cinetici grezzi dal lettore di micropiasche come file CSV, che verranno successivamente utilizzati come input per il pacchetto software phenotype microarray e il nostro software. Per eseguire l'analisi dei dati del fenotipo microarray, utilizzare il pacchetto software OmniLog phenotype micro Erik OPM che viene eseguito all'interno dell'ambiente software R.
In R studio, l'interfaccia utente grafica per R, installare il pacchetto OPM e le sue dipendenze utilizzando i comandi dettagliati nel manoscritto. Passare alla directory che contiene i file CSV dei dati cinetici e importare i dati utilizzando la funzione OPM di lettura. I dati cinetici possono essere aggregati e discretizzati utilizzando la stima dei parametri pref.
L'utilizzo della funzione XY plot consente di mappare le misurazioni della respirazione o della crescita in funzione del tempo per le piastre a 96 pozzetti di saggio. I dati possono essere visualizzati come una mappa di calore utilizzando il grafico del livello di funzione per consentire una rapida panoramica comparativa dei dati cinetici. Il passo successivo è identificare le reazioni e i geni associati ai nuovi metaboliti.
In caso di presenza di un modello esistente per le alghe, l'analisi dei dati dal sistema di microarray fenotipo può essere utilizzata per perfezionare questo modello. Qui presentiamo la pipeline che abbiamo utilizzato per il perfezionamento della rete metabolica su scala genomica per il modello Chlamydomonas utilizzando i dati del microarray fenotipo. Quando un nuovo composto risulta positivo per l'utilizzo, i profili di reazione rilevanti del composto vengono definiti utilizzando la base di conoscenza metabolica, fornendo i numeri di commissione enzimatica associati.
Il primo passo è quello di cercare Kegg e MetaCyc per identificare i numeri di commissione enzimatica, ECs, per le reazioni utilizzando metabolizzato trovato dagli array di composti chimici. Successivamente, utilizziamo i numeri EC identificati come base di ricerca in più risorse di annotazione algale disponibili, come Joint Genome Institute, JGI, Phytozome e pubblicazioni peer reviewed. Le reazioni e i metaboliti vengono aggiunti al modello di rete metabolica Chlamydomonas reinhardtii basato su COBRA, iRC1080, per espandere e perfezionare il modello.
Se non si trovano prove genetiche a sostegno del numero CE, è possibile eseguire una ricerca basata sul profilo come NCBI Position-Specific Iterative, NCBI PSI-BLAST, per identificare i geni candidati associati alla reazione. I risultati vengono quindi valutati manualmente. Coloro che superano questo passaggio QC con valori E inferiori a 0,05 per la pertinenza ai numeri EC di ricerca, vengono quindi aggiunti al modello metrico.
L'ultimo passo di questo protocollo è perfezionare il modello, valutare e confrontare i modelli. Utilizza l'ultima toolbox COBRA versione 3.0 e la piattaforma MATLAB per eseguire i passaggi per il perfezionamento del modello. Dopo aver installato la casella degli strumenti Cobra, è possibile scaricare il modello iRC1080.
Quindi, in MATLAB, la prima cosa da fare è passare alla cartella contenente il modello di riferimento, iRC1080. Aggiungere le reazioni identificate con i loro geni associati al modello metabolico, come iRC1080, utilizzando le funzioni della cassetta degli attrezzi Cobra. Aggiungi reazione e modifica l'associazione genica.
Passare alla directory che contiene il modello iRC1080 ed eseguire i comandi per caricare il modello. Rinominarlo e aggiungere una nuova reazione e il gene associato. In alcuni casi, quando il metabolita non viene prodotto per via intracellulare, ma viene prelevato dal mezzo, le reazioni di trasporto per i nuovi metaboliti devono essere aggiunte al modello utilizzando la funzione di reazione di aggiunta/scambio per immettere o emettere il metabolita nel mezzo extracellulare.
Testare il comportamento del nuovo risultato e modello, ad esempio iBD1106, eseguendo l'analisi del bilancio del flusso, FBA, utilizzando la funzione ottimizza il modello CB in condizioni di luce e buio per la massimizzazione della biomassa come funzione dell'oggetto. Tra gli altri, la soluzione FBA produce tre vettori: i flussi di reazione, i prezzi ombra del metabolita e i costi ridotti della reazione. Qui, viene fornito un esempio in cui il modello iRC1080 viene confrontato con la sua versione raffinata, iBD1106, ottenendo i prezzi ombra che rappresentano la sensibilità della funzione oggettiva della biomassa ai cambiamenti e ai metaboliti contabilizzato in ciascun modello.
Qui mostriamo i grafici XY di respirazione e i grafici di livello delle fonti di carbonio e le piastre di analisi delle fonti di azoto per il bianco e CC-503 rispettivamente in colore verde acqua e viola. All'interno di ciascun pozzo, le curve di respirazione rappresentano la conversione del colorante per riduzione in funzione del tempo. Il picco evidenziato nel pannello A rappresenta il rilevamento dell'acetato come unica fonte di carbonio da questa piastra, che è coerente con la letteratura Chlamydomonas.
Il confronto del numero di metaboliti identificati utilizzando tre diversi metodi, iRC1080, che è il modello metabolico ben curato di Chlamydomonas, il tempo di gascromatografia del volo GC-TOF e il saggio di microarray fenotipo mostra che solo sei metaboliti si sovrappongono tra i tre set, mentre 149 erano comuni tra iRC1080 e il set di analisi del fenotipo microarray. Ciò dimostra che mentre ogni tecnologia ha un punto di forza verso la ricerca sul profilo metabolico, il set di test del fenotipo microarray può essere una fonte significativa di nuove informazioni metaboliche. Le informazioni ottenute sono state utilizzate per espandere e perfezionare il modello di rete metabolica iRC1080.
Qui, confrontiamo il contenuto del modello iRC1080 e il modello espanso iBD1106, incluso il numero di reazioni, il numero di metaboliti e il numero di geni. Mostriamo che il nostro perfezionamento del modello ha aggiunto oltre 254 reazioni alla nuova rete risultante. Queste reazioni sono classificate in amminoacidi, dipeptidi, tripeptidi e reazioni di trasporto.
I metaboliti appena identificati sono stati utilizzati per l'espansione della rete metabolica e il perfezionamento del modello metabolico esistente di Chlamydomonas reinhardtii. I saggi di microarray fenotipo possono essere utilizzati per caratterizzare fenotipi metabolici di ceppi esistenti e di nuova isolati. Inoltre, il protocollo che abbiamo utilizzato nel contesto delle microalghe può guidare l'affinamento di modelli metabolici di altre specie.
