واحدة من التحديات الرئيسية في هندسة أنسجة القلب البشري يشمل الأوعية الدموية. وقد طور مختبرنا نموذجًا في المختبر لقلب الإنسان عن طريق زراعة الخلايا المشتركة الموجودة في الجسم الحي. وتشمل هذه myocytes القلبية، الخلايا الليفية القلبية والخلايا البطانية القلبية.
كل ذلك معا، وهذه الخلايا تسمح خلاصة البيئة الدقيقة قلب الإنسان بما في ذلك المكونات الجزيئية والخلوية، وخلوية إضافية. نستخدمها في مختبرنا لاختبار أدوية مختلفة لمقالات سمية المخدرات. وتشمل هذه الدوبسوروبيسين، وهو دواء معروف للرّد والذاتية التي تؤثر على قلوب البشر حتى بعد سنوات من العلاج.
نحن ثقافة الخلايا الليفية القلبية، والخلايا البطانية و myocytes بشكل منفصل قبل تشكيل spheroids. من أجل زراعة عضلة القلب، ونحن نجمع القارورة من ناقص 80 درجة ونحن الحارة في 37 درجة لمدة أربع دقائق في حمام مائي. ثم نقوم برش قارورة التبريد بنسبة 70٪ من الإيثانول ونقلها إلى خزانة السلامة الحيوية.
نجمع بلطف تعليق الخلية ونقلها إلى أنبوب فالكون 15 ملليلتر. نجمع ملليلتر واحد من وسط الطلاء قبل الارطار، ونشطف قارورة التبريد مرة واحدة ثم نضيفها إلى أنبوب فالكون 50 ملليلتر، قطرة واحدة في كل مرة كل أربع ثوان. في حين إضافة في المتوسطة الطلاء، يهز بلطف أنبوب فالكون.
مع ماصة الخلية، وجمع سبعة ملليلتر من متوسط الطلاء وإضافة بلطف إلى أنبوب فالكون 15 ملليلتر. مرة واحدة وأضاف الحجم النهائي للطلاء المتوسطة إلى أنبوب الصقر، ونقل تعليق الخلية إلى قارورة الأنسجة المبرمجة فيبرومينيكتين. وأخيراً، نقل الخلايا إلى حاضنة.
بعد يومين، نقوم بجمع قارورة الأنسجة من الحاضنة ونتحقق من التقاء الخلايا تحت المجهر. عند هذه النقطة، ونحن نقل القارورة إلى مجلس الوزراء السلامة الحيوية ونزيل المتوسطة الطلاء. نحن نغسل الخلايا بلطف بنفس المتوسطة من قارورة الأنسجة أربع أو خمس مرات.
نستبدلها بـ 10000000000000000000000000000000000000000000000000000000 في اليوم الذي نخلق به شنقات الثقافات، نجمع جميع أنواع الزنزانات الثلاثة من الحاضنة. نحن رقاقة في الخلايا عن طريق إزالة وسائل الإعلام.
نحن نشطفهم بثلاثة ملليلترات من برنامج تلفزيوني وأخيراً نضيف الرقائق إلى الخلايا ثم يتم نقل القارورة إلى حاضنة، وتحتضن لمدة تصل إلى خمس دقائق.
من أجل توليد spheroids القلبية، ونحن شارك في تربية 20،000 خلية لكل قطرة شنقا. وتشمل هذه 10،000 عضلة القلب، وألف الخلايا الليفية القلبية و5،000 الخلايا الداخلية القلب. هذا تربية متشاركة في يعلّق قطرة 384 صحون بئر.
إنها مطلية باستخدام نظامنا مناولة السوائل نضيف أيضا برنامج تلفزيوني على الجدران الجانبية للوحات قطرة معلقة لمنع الثقافات من الجفاف في الحاضنة. نقل بعناية لوحة قطرة معلقة تحتوي على خلايا إلى الحاضنة.
بين ثلاثة إلى أربعة أيام، سوف تتشكل spheroid. نجمع لوحة قطرة معلقة من الحاضنة ونتحقق من أن spheroids تتشكل داخل كل بئر. كما هو موضح في هذه الصور، لدينا مجموعة من الزفيرويدات داخل مركز كل بئر.
بمجرد تشكيلها، نجمع الرغوة وندمجها في المواد الهلامية للكولاجين. يتم قطع تلميح ماصة في الداخل وذلك لمنع الضرر spheroid. يتم جمع الـ(سبيرويدز) ونقلها إلى أنبوب فالكون 50 ملليلتر حيث يتم سحبها معاً
نحن تدور أسفل تعليق spheroid في 300 G لمدة خمس دقائق لفصلها عن المتوسطة. نستخدم 96 لوحة داكنة مسورة جيداً لصورة الرغوة، تتم إزالة الوسائط أو استبدالها بجل الكولاجين في أنبوب فالكون. يضاف هيدروكسيد الصوديوم إلى تعليق الجل الزفيرودي قبل أن يتم مطلية في لوحة الحائط الداكنة.
100 ميكرولتر من تعليق كروي يضاف إلى كل بئر ومحتضن لمدة 30 دقيقة في 37 درجة. يتم إضافة الأدوية، بما في ذلك دوكسوروبيسين وغيرها من العوامل إلى لوحة الزفيرويد وتحتضن لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، أعددنا حلا يحتوي على الكالسيوم AM و هوسم الإتيهيدوم، ووضع العلامات الحية تحت الخلايا على التوالي.
يتم تحضير هذا الحل في إضافة الدايم إلى لوحة التصفية هذه. ثم يتم احتضان السفح عند درجة 37 لمدة ساعة واحدة. نحن نستخدم قارئ لوحة لقياس الفلوريسنس من الكالسيوم AM بهم وهوم الايتيهيدوم في لوحة.
ثم يتم استخدام هذه القياسات من قبل برنامجنا لإجراء تحليل إحصائي. نحن قياس النشاط العقدي من الزفيرويدات تعامل مع الأدوية المختلفة باستخدام نظام بصري أيون. يتم نقل الـ(ثيرويدز) إلى المرحلة بين قطبين كهربائيين.
وهذه تسمح بالسيطرة على كل من النشاط العقدي وقياسه حسب الإمكانات الميدانية. وبهذه الطريقة، يمكننا اختبار مختلف الفولتية ونطاقات التردد لتحفيز spheroids. يتم تصوير الزفيرود في ذلك الوقت، ويستخدم لتلك القياسات.
سوف Spheroids التي لم تتلق دوكسوروبيسين تكون قادرة على بناء بعد التحفيز الكهربائي. على العكس من ذلك، سوف doxorubicin معالجتها spheroids لا العقد. لتصور شكل شبكة الخلايا البطانية داخل كل spheroid، نحن ثابتة لهم مع حل 4٪ شبه شكلي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
نقلنا لوحة إلى شاكر الذي يسمح تخلل لطيف من الحل من خلال هلام. تتم إزالة PFA وشطفها ثلاث مرات بمحلول PBS يحتوي على أكسيد الصوديوم بنسبة 0.01٪. لقد جلبنا التعبئة بالطبع عن طريق إضافة حل 0.02٪ من Triton X في PVSA لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
يحتوي حل الحظر على 3٪ BSA في PBC، ثم يضاف إلى اللوحة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. حل يحتوي على الأجسام المضادة الأساسية ضد CD 31. يتم إضافة علامة لل endothelial إلى اللوحة التي يتم احتضانها بين عشية وضحاها عند أربع درجات.
في اليوم التالي ، تتم إزالة محلول الأجسام المضادة الأولية وشطف اللوحة ثلاث مرات بمحلول PBS يحتوي على أكسيد صوديوم بنسبة 0.01٪. يتم إضافة حل الأجسام المضادة الثانوية التي تحتوي على وصمة عار ست عشرية كذلك إلى اللوحة التي يتم احتضانها بين عشية وضحاها عند أربع درجات. وأخيرا، تتم إزالة حل الأجسام المضادة الثانية وشطف لوحة ثلاث مرات مع حل برنامج تلفزيوني يحتوي على أكسيد الصوديوم 0.01٪.
بعد البقاء مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية ، يمكن تصوير اللوحة باستخدام المجهر confocal. شبكة الأوعية الدموية السليمة أمر بالغ الأهمية لبقاء الخلايا القلبية وظيفة. الزنجيات القلبية تقديم شبكة الخلايا البطانية التي يلخص أفضل واحد موجود في قلب الإنسان مقارنة بثقافات أحادية الطبقات من الخلايا القلبية.
ونظرا للميزات الفريدة، فإن اللولبيات القلبية تمثل أدوات متقدمة للاختبار في المختبر لأبحاث القلب والأوعية الدموية.
