Mühendislikteki en büyük zorluklardan biri insan kalp dokusunun vaskülaizasyonunu içerir. Laboratuvarımız in vivo bulunan hücreleri eş-culturing tarafından insan kalbinin bir in vitro modeli geliştirdi. Bunlar arasında kardiyak miyositler, kardiyak fibroblastlar ve kardiyak endotel hücreleri sayılabilir.
Bu hücreler, moleküler, hücresel ve ekstra hücresel bileşenleri de dahil olmak üzere insan kalbi mikroortamının yeniden kapitülasyonuna olanak sağlar. Biz ilaç toksisite denemeler için farklı ilaçlar test etmek için bizim laboratuvarda kullanabilirsiniz. Bu doksorubisin dahil, tedaviden sonra bile yıl insan kalplerini etkileyen iyi bilinen bir kardiyotoksik ilaç.
Spheroidler oluşturmadan önce kardiyak fibroblastları, endotel hücreleri ve miyositleri ayrı ayrı kültürediyoruz. Kardiyomiyosit yetiştirmek için şişeyi eksi 80 dereceden topluyoruz ve su banyosunda 4 dakika boyunca 37 derecede ısıtıyoruz. Daha sonra kriyo şişeyi %70 etanolle püskürtüp biyo-güvenlik kabinine taşıyoruz.
Biz yavaşça hücre süspansiyon toplamak ve 15 mililitrelik Falcon tüp aktarın. Biz prewarm kaplama orta bir mililitre toplamak, bir kez kriyo şişe durulayın ve sonra 50 mililitrelik Falcon tüp, her dört saniyede bir damla ekleyin. Kaplama ortamını eklerken, Falcon tüpünü hafifçe sallayın.
Bir hücre pipet ile, kaplama orta yedi mililitre toplamak ve yavaşça 15 mililitrelik Falcon tüp ekleyin. Falcon tüpüne kaplama ortamının son hacmi eklendikten sonra, hücre süspansiyonu fibronektin kodlu doku şişelerine aktarın. Son olarak, hücreleri bir kuvöze taşıyın.
İki gün sonra, kuvözden doku şişelerini topluyoruz ve mikroskop altında hücre birliğini kontrol ediyoruz. Bu noktada, şişeyi bir biyo-güvenlik dolabına taşıyAcağız ve kaplama ortamını çıkarıyoruz. Hücreleri, doku şişesinden aynı kaplama ortamıyla yavaşça dört ya da beş kez durulıyoruz.
Biz taze bakım ortamı ile değiştirin ve bir ila iki gün daha bir kuvöz onları hareket ettirin. Kültürlerin asılmış oluşturmak gün, biz kuluçka üç hücre türleri toplamak. Medyayı çıkararak hücreleri çipliyoruz.
Onları üç mililitre PBS ile durulıyoruz. Ve son olarak çipleri hücrelere ekliyoruz. Şişeler daha sonra bir kuvöze taşınır ve beş dakika kadar kuluçkaya yatırılır.
Kardiyak küresel oidler üretmek için, asma damla başına 20.000 hücreyi birlikte yetiştiriyoruz. Bunlar arasında 10, 000 kardiyomiyosit, bin kardiyak fibroblast ve 5,000 kardiyak iç hücre bulunmaktadır. Bunlar 384 kuyu plakası asma ortak kültürlü.
Sıvı işleme sistemimizi kullanıyorlar. Ayrıca kültürlerin kuluçka makinesinde kurumasını önlemek için asılı bırakma plakalarının yan duvarlarına PBS ekliyoruz. Hücreleri içeren asılı bırakma plakasını dikkatlice kuvöze taşıyın.
3-4 gün arasında küresel bir hastalık oluşur. Kuvözden asılı damla plakasını topluyoruz ve her kuyuda küresel lerin oluştuğunu kontrol ediyoruz. Bu görüntülerde gösterildiği gibi, her kuyunun merkezinde bir dizi küresel var.
Bir kez oluştuktan sonra, biz küresel toplamak ve kollajen jeller onları gömmek. Küresel hasarı önlemek için içeride bir pipet ucu kesilir. Küresel ler toplanır ve 50 mililitrelik falcon tüpüne aktarılır ve orada bir araya getirilirler.
Küresel süspansiyonu 300 G'de 5 dakika boyunca döndürüp ortamdan ayırıyoruz. Biz görüntü spheroids koyu duvarlı 96 iyi plakalar kullanın, medya kaldırılır veya bir Falcon tüp bir kollajen jel ile değiştirilir. Sodyum hidroksit, karanlık duvar plakasına kaplandırilmeden önce küresel jel süspansiyonuna eklenir.
Her kuyuya 100 mikrolitre küresel süspansiyon eklenir ve 37 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırılır. Doksorubisin ve diğer ajanlar da dahil olmak üzere ilaçlar küresel plakaya eklenir ve 24 saat kuluçkaya yatırılır. Ertesi gün, kalsiyum ve ethidyum homodimer içeren bir çözelti hazırladık, sırasıyla hücrelerin altında canlı etiketleme.
Bu çözüm, bu filtre plakasına kuruş eklenmesiyle hazırlanır. Spheroidler daha sonra bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırılır. Kalsiyum floresansını ve plakadaki ethidyum homodimer'ini ölçmek için bir levha okuyucu kullanıyoruz.
Bu ölçümler daha sonra istatistiksel bir analiz yapmak için yazılımımız tarafından kullanılır. İyon optik sistemi ile farklı ilaçlarla tedavi edilen küresellerin kontraktil aktivitesini ölçeriz. Spheroidler iki elektrot arasında sahneye taşınır.
Bunlar, kontraktil aktiviteyi alan potansiyeline göre hem kontrol etmenizi hem de ölçmenizi sağlar. Bu şekilde, küresel leri uyarmak için farklı voltaj ve frekans aralıklarını test edebiliriz. O anda bir küresel görüntülenir ve bu ölçümler için kullanılır.
Doksorubisin almayan spheroidler elektriksel uyarılma sonrasında inşa edebilecektir. Aksine, doksorubisin tedavi küresel sözleşme olmaz. Her küresel hücre içinde endotel hücre ağ formunu görselleştirmek için, oda sıcaklığında bir saat boyunca % 4 paraformaldehit çözeltisi ile sabitlendik.
Biz jel yoluyla çözeltinin nazik geçirbün sağlayan bir shaker plaka taşındı. PFA% 0.01 sodyum oksit içeren bir PBS çözeltisi ile kaldırılır ve üç kez durulanır. Biz oda sıcaklığında 20 dakika PVSA Triton X% 0.02 çözüm ekleyerek tabii ki seferberlik getirdi.
Engelleme çözeltisi PBC%3 BSA içerir ve bu da oda sıcaklığında bir saat boyunca tabağa eklenir. CD 31'e karşı birincil antikor içeren bir çözüm. Endotel için bir belirteç daha sonra dört derece bir gecede kuluçka plaka eklenir.
Ertesi gün, birincil antikor çözeltisi çıkarılır ve plaka % 0.01 sodyum oksit içeren bir PBS çözeltisi ile üç kez durulanır. Heks lekesini de içeren ikincil antikor solüsyonu, bir gecede dört derecede kuluçkaya yatırılabilen tabağa eklenir. Son olarak, ikinci antikor çözeltisi çıkarılır ve plaka % 0.01 sodyum oksit içeren bir PBS çözeltisi ile üç kez durulanır.
Primer ve sekonder antikorlarla kaldıktan sonra, plaka konfokal mikroskobumuz kullanılarak görüntülenebilir. Uygun bir vasküler ağ kardiyak hücre sağkalım ve fonksiyonu için önemlidir. Kardiyak spheroidler, insan kalbinde bulunan bir hücre ağını, kardiyak hücrelerin monokatmanlı kültürlerine göre daha iyi özetleyen bir endotel hücre ağı sunarlar.
Benzersiz özellikleri göz önüne alındığında, kardiyak spheroids kardiyovasküler araştırma için in-vitro test için gelişmiş araçları temsil eder.
