Eine der größten Herausforderungen bei der Entwicklung eines menschlichen Herzgewebes ist seine Vaskularisation. Unser Labor hat ein In-vitro-Modell des menschlichen Herzens entwickelt, indem es Zellen in vivo mitkultiviert. Dazu gehören Herzmyozyten, Herzfibroblasten und Herzendothelzellen.
Insgesamt ermöglichen diese Zellen die Rekapitulation der mikromenschlichen Herzumgebung einschließlich ihrer molekularen, zellulären und zusätzlichen zellulären Komponenten. Wir verwenden sie in unserem Labor, um verschiedene Medikamente auf Aufsätze zur Arzneimitteltoxizität zu testen. Dazu gehören Doxorubicin, ein bekanntes kardiotoxisches Medikament, das die menschlichen Herzen auch Jahre nach seiner Behandlung betrifft.
Wir kultiessen Herzfibroblasten, Endothelzellen und Myozyten getrennt, bevor wir Sphäroide bilden. Um Kardiomyozyten anzubauen, sammeln wir die Durchstechflasche ab minus 80 Grad und wärmen sie vier Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad. Wir sprühen dann die Kryo-Flasche mit 70% Ethanol und bringen sie in einen Bio-Sicherheitsschrank.
Wir sammeln die Zellsuspension vorsichtig und übertragen sie in ein 15 Milliliter Falcon Rohr. Wir sammeln einen Milliliter Vorwärme-Beschichtungsmedium, spülen die Kryo-Flasche einmal ab und fügen sie dann in die 50-Milliliter-Falcon-Röhre, ein Tropfen nach dem anderen alle vier Sekunden. Während Sie das Beschichtungsmedium hinzufügen, schütteln Sie das Falcon-Rohr vorsichtig.
Mit einer Zellpipette sieben Milliliter Beschichtungsmedium sammeln und sanft in das 15 Milliliter Falcon Rohr geben. Nachdem Sie das endgültige Volumen des Beschichtungsmediums in das Falcon-Rohr gegeben haben, übertragen Sie die Zellsuspension auf die fibronectin-codierten Gewebekolben. Schließlich verschieben Sie Zellen in einen Inkubator.
Nach zwei Tagen sammeln wir die Gewebekolben aus dem Inkubator und überprüfen den Zellzusammenfluss unter dem Mikroskop. An dieser Stelle bewegen wir den Kolben in einen Bio-Sicherheitsschrank und entfernen das Beschichtungsmedium. Wir spülen Zellen mit dem gleichen Beschichtungsmedium vier- oder fünfmal vorsichtig aus dem Gewebekolben.
Wir ersetzen es durch frisches Wartungsmedium und verlegen sie für ein bis zwei weitere Tage in einen Inkubator. An dem Tag, an dem wir Erhängen von Kulturen erstellen, sammeln wir alle drei Zelltypen aus dem Brutkasten. Wir hacken Zellen, indem wir die Medien entfernen.
Wir spülen sie mit drei MilliliterPBS. Und schließlich fügen wir die Chips in die Zellen. Die Flaschen werden dann in einen Inkubator gebracht und bis zu fünf Minuten inkubiert.
Um Herzsphäroide zu erzeugen, bilden wir 20.000 Zellen pro hängendem Tropfen mit. Dazu gehören 10.000 Kardiomyozyten, tausend Herzfibroblasten und 5 000 Herzinnenzellen. Diese sind in hängenden Tropfen 384 Brunnenplatten mitkultiviert.
Sie werden mit unserem Flüssigkeitshandling-System plattiert. Wir fügen auch PBS an den Seitenwänden der hängenden Fallplatten hinzu, um zu verhindern, dass die Kulturen im Brutkasten austrocknen. Bewegen Sie vorsichtig die hängende Fallplatte mit Zellen in den Inkubator.
Zwischen drei und vier Tagen bildet sich Sphäroid. Wir sammeln die hängende Fallplatte aus dem Inkubator und überprüfen, ob sich in jedem Brunnen Sphäroide bilden. Wie in diesen Bildern gezeigt, haben wir eine Reihe von Sphäroiden in der Mitte jedes Brunnens.
Einmal gebildet, sammeln wir Sphäroide und betten sie in Kollagengele ein. Eine Pipettenspitze wird innen geschnitten, um Sphäroidschäden zu verhindern. Sphäroide werden gesammelt und in ein 50 Milliliter Falcon Rohr übertragen, wo sie zusammengezogen werden.
Wir drehen die Sphäroid-Aufhängung bei 300 G für fünf Minuten herunter, um sie vom Medium zu trennen. Wir verwenden dunkelwandige 96 Well-Platten, um Sphäroide abzubilden, das Medium wird entfernt oder durch ein Kollagengel in einem Falcon-Rohr ersetzt. Natriumhydroxid wird der Sphäroid-Gelsuspension zugesetzt, bevor sie in die dunkle Wandplatte eintellert werden.
100 Mikroliter Sphäroidsuspension wird in jeden Brunnen zugegeben und 30 Minuten bei 37 Grad inkubiert. Medikamente, einschließlich Doxorubicin und andere Mittel werden der Sphäroidplatte zugesetzt und 24 Stunden lang inkubiert. Am nächsten Tag bereiteten wir eine Lösung vor, die Calcium AM und Ethidium-Homodimer enthält und live unter den Zellen etikettiert.
Diese Lösung wird vorbereitet, indem der Dime zu dieser Filterplatte hinzugefügt wird. Sphäroide werden dann bei 37 Grad für eine Stunde inkubiert. Wir verwenden einen Plattenleser, um die Fluoreszenz von Calcium AM und deren Ethidium-Homodimer in der Platte zu messen.
Diese Messungen werden dann von unserer Software verwendet, um eine statistische Analyse durchzuführen. Wir messen die kontraktile Aktivität von Sphäroiden, die mit den verschiedenen Medikamenten behandelt werden, mit einem Ionenoptiksystem. Sphäroide werden zwischen zwei Elektroden auf die Bühne verschoben.
Diese ermöglichen es, die kontraktile Aktivität sowohl nach Feldpotenzial zu steuern als auch zu messen. Auf diese Weise können wir verschiedene Spannungen und Frequenzbereiche testen, um Sphäroide zu stimulieren. Ein Sphäroid wird zu diesem Zeitpunkt abgebildet und für diese Messungen verwendet.
Sphäroide, die Doxorubicin nicht erhalten haben, können nach der elektrischen Stimulation konstruieren. Im Gegenteil, Doxorubicin behandelt Sphäroide werden nicht zusammenziehen. Um die Endothelzellnetzwerkform in jedem Sphäroid zu visualisieren, haben wir sie mit einer 4%paraformalen Dehydlösung für eine Stunde bei Raumtemperatur fixiert.
Wir bewegten die Platte zu einem Shaker, der die sanfte Durchlässigkeit der Lösung durch das Gel ermöglicht. Das PFA wird mit einer PBS-Lösung, die 0,01% Natriumoxid enthält, dreimal entfernt und ausspült. Wir haben natürlich mobilisiert, indem wir eine 0,02%ige Lösung von Triton X in PVSA für 20 Minuten bei Raumtemperatur hinzugefügt haben.
Die Blockierlösung enthält 3%BSA in PBC, die dann für eine Stunde bei Raumtemperatur auf die Platte aufgesetzt wird. Eine Lösung, die den primären Antikörper gegen CD 31 enthält. Der Platte wird ein Marker für Endothel hinzugefügt, der dann über Nacht bei vier Grad inkubiert wird.
Am nächsten Tag wird die primäre Antikörperlösung entfernt und die Platte dreimal mit einer PBS-Lösung mit 0,01 % Natriumoxid abspült. Die sekundäre Antikörperlösung, die auch den Sechskantfleck enthält, wird der Platte zugesetzt, die dann über Nacht bei vier Grad inkubiert wird. Schließlich wird die zweite Antikörperlösung entfernt und die Platte dreimal mit einer PBS-Lösung mit 0,01% Natriumoxid entspült.
Nach einem Aufenthalt mit primären und sekundären Antikörpern kann die Platte mit unserem konfokalen Mikroskop abgebildet werden. Ein richtiges Gefäßnetzwerk ist entscheidend für das Überleben und die Funktion der Herzzellen. Herzsphäride stellen ein endothelialezelliges Netzwerk dar, das das im menschlichen Herzen vorhandene besser rekapituliert als monolayer Kulturen von Herzzellen.
Angesichts der einzigartigen Eigenschaften stellen Herzsphäroide fortschrittliche Werkzeuge für In-vitro-Tests für kardiovaskuläre Forschung dar.
