인간의 심장 조직을 엔지니어링하는 주요 과제 중 하나는 혈관을 포함한다. 우리의 실험실은 생체 내에서 발견 된 세포를 공동 배양하여 인간의 심장의 체외 모델을 개발했습니다. 이들은 심장 심근세포, 심장 섬유아세포 및 심장 내피 세포를 포함합니다.
모두 함께, 이러한 세포는 분자를 포함 하 여 인간의 심장 미세 환경의 회수를 허용, 세포, 그리고 여분의 세포 구성 요소. 우리는 약물 독성 에세이에 대한 다른 약물을 테스트하기 위해 실험실에서 사용합니다. 여기에는 치료 후 몇 년 동안 인간의 마음에 영향을 미치는 잘 알려진 심장 독성 약물인 독소루비신이 포함됩니다.
우리는 스페로이드를 형성하기 전에 심장 섬유아세포, 내피 세포 및 근세포를 별도로 배양합니다. 심근세포를 재배하기 위해 영하 80도에서 바이알을 수집하고 수조에서 4분 동안 37도에서 따뜻하게 합니다. 그런 다음 냉동 유리알을 70%에탄올로 분사하여 바이오 안전 캐비닛으로 옮습니다.
우리는 부드럽게 셀 서스펜션을 수집하고 15 밀리리터 팔콘 튜브로 전송합니다. 우리는 프리 웜 도금 매체의 1 밀리리터를 수집, 한 번 냉동 고리 알을 헹구고 50 밀리리터 팔콘 튜브에 추가, 한 번에 한 방울, 4 초마다 한 방울. 도금 매체에 추가하는 동안 팔콘 튜브를 부드럽게 흔들어 줍니다.
셀 파이펫을 사용하여 7 밀리리터의 도금 매체를 수집하고 15 밀리리터 팔콘 튜브에 부드럽게 추가합니다. 팔콘 튜브에 도금 매체의 최종 부피를 추가한 후, 세포 현탁액을 섬유네틴 코딩 된 조직 플라스크로 옮기십시오. 마지막으로 세포를 인큐베이터로 이동합니다.
이틀 후, 우리는 인큐베이터에서 조직 플라스크를 수집하고 우리는 현미경으로 세포 합류를 확인합니다. 이 시점에서 플라스크를 바이오 안전 캐비닛으로 옮기고 도금 매체를 제거합니다. 우리는 부드럽게 조직 플라스크에서 동일한 도금 매체로 세포를 4 ~ 5 번 헹구십시오.
우리는 신선한 유지 보수 매체로 교체하고 1 ~ 2 일 동안 인큐베이터로 이동합니다. 문화의 매달려를 만드는 날, 우리는 인큐베이터에서 세 가지 세포 유형을 모두 수집합니다. 우리는 매체를 제거하여 세포에 칩.
우리는 PBS의 세 밀리리터로 그들을 헹구는. 그리고 마지막으로 우리는 셀에 칩을 추가합니다. 그런 다음 플라스크는 인큐베이터로 이동하고 최대 5분 동안 배양됩니다.
심장 스페로이드를 생성하기 위해, 우리는 매달려 드롭 당 20, 000 세포를 공동 배양합니다. 여기에는 10, 000 심근세포, 천 개의 심장 섬유아세포 및 5, 000 개의 심장 내부 세포가 포함됩니다. 이들은 매달려 드롭 384 웰 플레이트에 공동 배양된다.
액체 처리 시스템을 사용하여 도금됩니다. 우리는 또한 배양이 인큐베이터에서 건조되는 것을 방지하기 위해 매달려 있는 드롭 플레이트의 사이드 월에 PBS를 추가합니다. 세포를 포함하는 매달려 있는 낙하판을 인큐베이터로 조심스럽게 옮기습니다.
3~4일 사이에 스페로이드가 형성됩니다. 우리는 인큐베이터에서 매달려 있는 드롭 플레이트를 수집하고 각 우물 내에서 스페로이드가 형성되고 있는지 확인합니다. 이러한 이미지에 표시된 것처럼 각 우물의 중앙 에 스페로이드 세트가 있습니다.
일단 형성되면, 우리는 스페로이드를 수집하고 콜라겐 젤에 포함. 피펫 팁이 내부에서 절단되어 스페로이드 손상을 방지합니다. 스페로이드는 수집되어 50밀리리터 팔콘 튜브로 옮겨져 함께 조립됩니다.
우리는 배지에서 분리하기 위해 5 분 동안 300G에서 스페로이드 서스펜션을 회전합니다. 우리는 어두운 벽96 웰 플레이트를 사용하여 스페로이드를 이미지하고, 미디어는 팔콘 튜브의 콜라겐 젤로 제거되거나 대체됩니다. 수산화 나트륨은 어두운 벽 판에 도금되기 전에 스페로이드 젤 현탁액에 첨가됩니다.
스페로이드 서스펜션 100마이크로리터가 각 우물에 첨가되어 37도에서 30분 동안 배양됩니다. 독소루비신 및 기타 제제를 포함한 약물은 스페로이드 플레이트에 첨가되어 24시간 동안 배양됩니다. 다음 날, 우리는 칼슘 AM과 에디듐 호모이머를 포함하는 용액을 준비하여 각각 세포 아래에 서식라벨을 붙였습니다.
이 솔루션은 이 필터 플레이트에 동전을 추가할 때 제조됩니다. 스페로이드는 1시간 동안 37도에서 배양됩니다. 우리는 접시 판독기를 사용하여 칼슘 AM의 형광과 접시에 있는 그들의 에디듐 호모이머를 측정합니다.
이러한 측정은 당사 소프트웨어에서 통계 분석을 수행하는 데 사용됩니다. 우리는 이온 광학 시스템을 사용하여 다른 약물로 처리 된 스페로이드의 수축 활성을 측정합니다. 스페로이드는 두 전극 사이의 단계로 이동됩니다.
이를 통해 필드 잠재력에 따라 수축 활동을 제어하고 측정할 수 있습니다. 이러한 방식으로 다양한 전압 및 주파수 범위를 테스트하여 스페로이드를 자극할 수 있습니다. 당시의 스페로이드가 이미지화되어 해당 측정에 사용됩니다.
독소루비신을 받지 않은 스페로이드는 전기 자극에 따라 시공할 수 있다. 반대로, 독소루비신 처리 스페로이드는 계약하지 않습니다. 각 스페로이드 내에서 내피 세포 네트워크 형태를 시각화하기 위해 실온에서 1 시간 동안 4 % 파라 포름알데히드 용액으로 고정했습니다.
우리는 젤을 통해 용액의 부드러운 투과를 허용하는 셰이커로 접시를 옮겼습니다. PFA는 0.01%의 산화나트륨을 함유한 PBS 용액으로 3회 제거및 헹구는 것이다. 우리는 실온에서 20 분 동안 PVSA에 Triton X의 0.02 %의 솔루션을 추가하여 물론 동원을 가져왔습니다.
차단 솔루션에는 PBC의 3%BSA가 포함되어 있으며, 실온에서 1시간 동안 플레이트에 추가됩니다. CD(31)에 대한 1차 항체를 함유하는 용액. 내피성 마커가 접시에 추가되어 하룻밤 사이에 4도에서 배양됩니다.
다음 날, 1차 항체 용액이 제거되고 플레이트는 0.01%의 산화나트륨을 함유한 PBS 용액으로 세 번 헹구었다. 육각 얼룩을 함유하는 이차 항체 용액은 플레이트에 첨가되어 하룻밤 사이에 4도에서 배양됩니다. 마지막으로, 제2 항체 용액이 제거되고 플레이트는 0.01%의 산화나트륨을 함유한 PBS 용액으로 세 번 헹구었다.
1 차 및 이차 항체와 함께 머무른 후, 플레이트는 우리의 공초점 현미경을 사용하여 심화될 수 있습니다. 적절한 혈관 네트워크는 심장 세포 생존 과 기능에 매우 중요합니다. 심장 스페로이드는 심장 세포의 단층 배양에 비해 인간의 심장에 존재하는 것을 더 잘 재구성하는 내피 세포 네트워크를 제시합니다.
독특한 특징을 감안할 때, 심장 스페로이드는 심혈관 연구를 위한 체외 검사를 위한 고급 공구를 나타냅니다.
