אנו משתמשים בפרוטוקול זה כדי ליצור תאי אב עצביים מפיברובלסטים של עור החולה וללמוד מחלות נוירולוגיות ונוירודגנרטיביות. אנחנו מרגישים שלפרוטוקול הזה יש יתרונות רבים על פני טכנולוגיית שב"ס קלאסית, כולל המהירות, אבל גם לקבל במקרים מסוימים פנוטיפ מחלה חמורה יותר. אנו חוקרים מחלות נוירולוגיות ונוירודגנרטיביות ושימוש בדגימות עור מאפשר לנו באמת להעריך את המגוון של המטופלים גם כן.
המעבדה שלי מתעניינת במיוחד בתפקיד האסטרוציטים במחלות ואנחנו משתמשים באסטרוציטים שאנו מייצרים מה-NPCs כדי לבדוק תרופות וגם כדי לחקור מנגנוני מחלה, אך גם בתרבויות משותפות עם נוירונים אנושיים ועכבריים. אנו מקווים פרוטוקול זה הולך להיות אינפורמטיבי ובבקשה להגיע אם יש לך שאלות. תודה.
השתמש פיברובלסטים העור האנושי העיקרי שניתן להשיג בנקים תאים או ביופסיות העור. תאי תרבות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית רקמת 5%CO2. תאי מעבר לפחות קטע אחד עד שני קטעים לאחר הפשרה לפני השימוש בניסוי.
ברגע שהתאים מוכנים, מצפים באר של צלחת שש בארות עם פיברונקטין אנושי בריכוז של 1:200 מדולל ב- PBS בטמפרטורת החדר במשך 15 עד 20 דקות. הכן מדיה פיברובלסטית כפי שמוצג בטבלה הראשונה. כאשר התאים מוכנים להיות מצופים, להסיר את fibronectin מן המנה ומיד להוסיף פתרון התא או שני מיל של מדיה fibroblast.
אל תתנו למנה להתייבש לפני הוספת מדיה. תלוי כמה מהר התאים גדלים, צלחת 150, 000 עד 200, 000 פיברובלסטים בשתי בארות של צלחת שש בארות מצופה פיברונקטין אנושי. תאי תרבות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית רקמת 5%CO2.
יום לאחר הזריעה, בדקו את הפיברובלסטים מתחת למיקרוסקופ וודאו שצפיפות התאים היא בין 70 ל-85% מתמרים באר אחת עם כל ארבעת הווקטורים הרטרו-ויראליים:Oct3/4, Klf4, Sox2 ו- c-Myc. השתמש בריבוי של זיהום של 10 לגידול מהיר או 15 עבור fibroblasts הגדלים לאט. יעילות התמרה חייבת לחרוג מ- 70% או יותר תאים חיוביים עבור כל וקטור.
הוסיפו מדיום פיברובלסט רגיל לתערובת ויראלית בנפח כולל של מיליון לבאר. השאירו את התאים השניים שאינם מטופלים היטב והחזירו תאים לחממת תרבית הרקמות כדי להדגיר בן לילה. יום לאחר התמרמרות, לשטוף תאים פעם אחת עם PBS ולהוסיף מדיה פיברובלסט טרי מיליון אחד.
תאי תרבות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית רקמת 5%CO2. למחרת, הכן מדיית המרה כפי שמוצג בטבלה הראשונה ושטוף תאים פעם אחת עם PBS כדי להיפטר משורי המדיה הפיברובלסטית, ולאחר מכן הוסף מיליון אחד של מדיום המרה. שנה את המדיה של הבאר הלא מטופלת גם למדיית המרה.
שימו לב לתאים מתחת למיקרוסקופ וצפו בשינויים במורפולוגיה. מדיה סלולרית צריכה להיות מוחלפת מדי יום לאורך כל תהליך ההמרה עם אחד עד שני מיל של מדיה המרה עבור תרבות iNPC הבאים. שנה מדיה על-ידי הסרה קפדנית של 70% מדיה מהבאר תוך הקפדה שהתאים יישארו מכוסים ב- 30% הנותרים של המדיה.
המשך להתבונן בתאים ולשנות מדיה מדי יום עם מיל אחד עד שני מיל של מדיה המרה. לאחר כחמישה עד שישה ימים במדיית המרה או כאשר התאים הופכים צפופים מאוד, להעביר אותם אחד עד שניים או מקסימום אחד עד שלושה. לחמם Accutase ומעיל מספר מתאים של בארות בצלחת שש באר עם אחד mil הכולל fibronectin מדולל 1:200 ב PBS במשך 15 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר.
לשטוף תאים בזהירות עם PBS מבלי לנתק את כל התאים. השתמש בקיר הבאר כדי להחיל PBS בעדינות על התאים. הסר בזהירות PBS עם פיפטות או על-ידי שאיפה.
הוסף 500 מיקרוליטר Accutase ודגר שתיים עד שלוש דקות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית רקמות. בדוק מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שרוב התאים התנתקו. אם התאים ירדו, הוסף שני מיל של מדיית המרה טרייה ופיפט בעדינות למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש פעמים כדי לנתק גושים.
לאסוף את התאים בצינור 15 מיל ולהוסיף שלושה מיל מדיה כדי לדלל עוד יותר את Accutase. צנטריפוגה במשך ארבע דקות ב 200 G בטמפרטורת החדר. הסר supernatant מן גלולת התא ו resuspend התאים במיל אחד של מדיום טרי.
בעדינות פיפטה למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש פעמים כדי לפתור גושי תאים. הסר fibronectin משש בארות מצופות ולהוסיף מדיה אחת רעננה מיליון לכל באר מיד. עבור יחס פיצול של 1:2, להוסיף 500 microliters של המתלה התא בבאר אחת והשני 500 בבאר שנייה.
להפיץ את התאים על ידי בעדינות לנער את שש גם בכיוון צפון-דרום מזרח-מערב ולשים באינקובטור תרבית רקמה 37 מעלות. שימו לב לתאים שמתחת למיקרוסקופ למחרת ושנו את המדיה במיל עד שני מיל. שנה מדיה מדי יום עד שהתאים יהיו מוכנים לפיצול שוב.
הכן מדיה NPC המכיל FGF בריכוז מוגבר ללא EGF או הפרין כפי שניתן לראות בטבלה הראשונה. בפיצול חדש זה, זרע באר אחת של תאים במדיית המרה והשני היטב במדיה NPC. המשך לשנות מדיה של iNPCs מדי יום באמצעות מיל אחד עד שני מיל של מדיית NPC.
הכן מדיית אסטרוציטים לפי טבלה 1. כדי להפוך אסטרוציטים מ- iNPCs טריים, זרע iNPCs ישירות 10 מיל של מדיה אסטרוציטים ב 10 ס"מ מצופה פיברונקטין לוחות כך שהם סביב 10%confluency למחרת. תאי תרבות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית רקמת 5%CO2.
שנה מדיום עם 10 מיל של מדיה אסטרוציטים שלושה ימים לאחר הציפוי. שמור על התאים מבדילים במשך חמישה עד שבעה ימים. כדי לזרוע ניסויים, פצל את האסטרוציטים באמצעות טריפסין או Accutase כמתואר בשלב 2 עד 2.6.
צפיפות זריעה מומלצת כלולה בטבלה 2. הוראות כיצד לחלק iNPCs כדי ליצור אסטרוציטים המושרה ממוקמים בטבלה שלוש. כדי להפוך אסטרוציטים ממניות iNPC קפואות, להסיר קובץ מלאי חלק ממיכל אחסון חנקן נוזלי במהירות להפשיר ב 37 מעלות צלזיוס.
ברגע שהתאים מפשירו, פתרון תא פיפטה בצינור 15 מיליון המכיל חמישה מיל של מדיה אסטרוציטים. צנטריפוגה במשך ארבע דקות בטמפרטורת חדר 200 G. הסר supernatant ו resuspend במדיום אסטרוציטים טריים מיליון אחד.
הוסיפו תשעה מיל בינוני אסטרוציטים טריים לצלחת 10 ס"מ מצופה פיברונקטין והוסיפו תמיסת תא מיליון אחת, המפיצה בעדינות תאים בתנועה צפון-דרום-מזרחית-מערבית. תאי תרבות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית רקמת 5%CO2. פרוטוקול זה מאפשר ייצור מהיר וקל של iNPCs ישירות מן העור האנושי fibroblasts באמצעות retroviruses המכיל את גורמי Yamanaka.
שיטה זו מאפשרת לעקוף את מצב תאי הגזע ואת הצורך בבחירת שיבוטים, ובכך למנוע וריאציה שיבוט. צעדים חשובים שיש לזכור בזמן שהתאים עוברים את תהליך ההמרה הם צפיפות הזריעה הפיברובלסטית, ה- pH של המדיה ושמירה על התאים במפגש אופטימלי. באיור הראשון ניתן למצוא דוגמאות לשינויים אופטימליים במפגש ובמורפולוגיה.
לאחר השלמת תהליך ההמרה, NPCs יציגו ביטוי מופחת מאוד או ללא ביטוי של סמנים פיברובלסטים ומורפולוגיה ובטא סמני תאים ספציפיים ל- NPC. יתר על כן, הם יכולים לשמש גם ליצירת קווי תאים שונים כמו נוירונים המושרה, אוליגודנדרוציטים, ואסטרוציטים. מניסיוננו, אסטרוציטים המושרה בפרט הם בעלי ערך רב עבור בדיקות מנגנון תרופות ומחלות כפי שהם יכולים להיווצר באוכלוסיות טהורות במספרים גדולים לשחזור.
אסטרוציטים המושרה ניתן להבדיל iNPCs על ידי לקיחת aliquot קטן של תאים במהלך פיצול או חלק iNPC קפוא בעבר ציפוי ישירות במדיה אסטרוציטים. שיקולים חשובים במהלך תהליך זה הם שמירה על צפיפות הזריעה הראשונית של iNPCs נמוך כמו צפיפות זריעה גבוהה הוכח לעכב את תהליך הבידול, ותשומת לב נוספת pH התקשורת כמו חומציות יכול להפעיל אפילו אסטרוציטים בריאים. לסיכום, פרוטוקול ההמרה הישירה היא שיטה מהירה מאוד כדי להיות מסוגל להפוך תאי אב עצביים מדגימות העור המטופל.
זה מאפשר ללמוד מספר גדול יותר של דגימות תאים בו זמנית באמת להסתכל על גיוון בהקשר המחלה. אנחנו מרגישים שזה מבחנה חזקה מאוד, כי אתה יכול להשתמש כדי להפוך תאי אב עצביים, נוירונים, אלא גם אסטרוציטים כי אז ניתן להשתמש גם בתרבות משותפת או בעצמם עבור בדיקות סמים או מחקרים מכניים גם כן.
