Мы используем этот протокол, чтобы сделать нейронные клетки-предшественники из фибробластов кожи пациента и изучать неврологические и нейродегенеративные заболевания. Мы считаем, что этот протокол имеет много преимуществ по сравнению с классической технологией IPS, в том числе скорость, но и получить в некоторых случаях более тяжелой болезни фенотипа. Мы изучаем неврологические и нейродегенеративные заболевания и с помощью образцов кожи позволяет нам действительно оценить разнообразие пациентов, а также.
Моя лаборатория особенно заинтересована в роли астроцитов при заболеваниях, и мы используем астроциты, которые мы делаем из NPC для тестирования лекарств, а также для изучения механизмов заболевания, но и в совместной культуры с человека и мыши нейронов. Мы надеемся, что этот протокол будет информативным и, пожалуйста, про обращайтесь, если у вас есть какие-либо вопросы. Спасибо.
Используйте первичные фибробласты кожи человека, которые могут быть получены из клеточных банков или биопсии кожи. Культурные клетки при 37 градусах Цельсия в инкубаторе культуры тканей 5%CO2. Проходные клетки, по крайней мере один-два прохода после оттаивания до использования в эксперименте.
После того, как клетки будут готовы, пальто из шести хорошо пластины с человеком фибронектин в 1:200 концентрации разбавленной в PBS при комнатной температуре в течение 15 до 20 минут. Подготовье фибробластовых мультимедиа, как показано в таблице 1. Когда клетки будут готовы к помойки, удалить фибронектин из блюда и сразу же добавить клеточный раствор или два мил фибробласта средств массовой информации.
Не позволяйте блюду высохнуть до добавления средств массовой информации. В зависимости от того, как быстро растут клетки, пластина от 150 000 до 200 000 фибробластов в двух колодцах человеческой фибронектиновой пластины с шестью скважинами. Культурные клетки при 37 градусах Цельсия в инкубаторе культуры тканей 5%CO2.
На следующий день после посева проверьте фибробласты под микроскопом и убедитесь, что плотность клеток составляет от 70 до 85%Transduce один хорошо со всеми четырьмя ретровирусными векторами:Oct3/4, Klf4, Sox2, и c-Myc. Используйте множество инфекций 10 для быстрорастущих или 15 для медленно растущих фибробластов. Эффективность трансдукции должна превышать 70% или более положительных ячеек для каждого вектора.
Добавить регулярные фибробластов среднего вирусного микса для общего объема одного мил на колодец. Оставьте второй хорошо необработанных и вернуть клетки в инкубатор культуры тканей инкубировать на ночь. На следующий день после трансдукции, мыть клетки один раз с PBS и добавить один мил свежих фибробластов сми.
Культурные клетки при 37 градусах Цельсия в инкубаторе культуры тканей 5%CO2. На следующий день, подготовить преобразования средств массовой информации, как показано в таблице один и мыть клетки один раз с PBS, чтобы избавиться от остаточного фибробластового носителя, а затем добавить один мил преобразования среды. Измените средства массовой информации необработанных хорошо преобразования средств массовой информации, а также.
Наблюдайте за клетками под микроскопом и следите за изменениями в морфологии. Сотовые средства массовой информации должны быть заменены ежедневно на протяжении всего процесса преобразования с одним-двумя милами средств преобразования и для последующей культуры iNPC. Измените средства массовой информации, тщательно удалив 70% средств массовой информации из колодец, убедившись, что ячейки остаются покрыты в оставшихся 30% средств массовой информации.
Продолжайте наблюдать за ячейками и менять средства массовой информации ежедневно с одним-двумя милами конверсии средств массовой информации. Примерно через пять-шесть дней в средствах преобразования или когда клетки становятся очень плотными, прохождение их от одного до двух или максимум один-три. Разогреть Accutase и покрыть соответствующее количество скважин в шесть скважин пластины с одним мил общей фибронектин разбавленной 1:200 в PBS в течение 15 до 20 минут при комнатной температуре.
Тщательно вымойте клетки с помощью PBS, не отсоединяя клетки. Используйте стенку колодец, чтобы мягко нанесите PBS на клетки. Аккуратно удалите PBS с пипетки или аспирации.
Добавьте 500 микролитров Accutase и инкубировать две-три минуты при 37 градусах цельсия в инкубаторе культуры тканей. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что большинство клеток отделились. Если клетки откололись, добавьте два милли свежих средства преобразования и аккуратно пипетки вверх и вниз два-три раза, чтобы разобщить сгустки.
Соберите клетки в трубку 15 миль и добавьте три милли для дальнейшего разбавления Accutase. Центрифуга в течение четырех минут при температуре 200 Г при комнатной температуре. Удалите супернатант из клеточной гранулы и повторно посовелите клетки в один мил свежей среды.
Аккуратно пипетки вверх и вниз два-три раза, чтобы решить ячейки сгустки. Удалите фибронектин из шести колодцев с покрытием и немедленно добавьте по одному млн свежих средств массовой информации к каждому колодцеву. Для разделения соотношения 1:2 добавьте 500 микролитров клеточной подвески в одну колодец, а другую 500 в секунду.
Распределите клетки, мягко встряхивая шесть хорошо в северо-юго-западном направлении и положить в 37 градусов культуры ткани инкубатора. Наблюдайте за клетками под микроскопом на следующий день и меняйте мультимедиа с одного-двух мил. Меняй мультимедиа каждый день, пока ячейки не будут готовы к разделению снова.
Подготовка NPC-медиа, содержащих FGF с повышенной концентрацией без EGF или гепарина, как видно из таблицы 1. На этом новом разделении, семя одного хорошо клеток в средствах преобразования, а другой хорошо в NPC средств массовой информации. Продолжайте менять средства массовой информации iNPCs ежедневно с одним-двумя милами NPC средств массовой информации.
Подготовка астроцитов СМИ в соответствии с таблицей 1. Чтобы сделать астроциты из свежих iNPCs, семена iNPCs непосредственно в 10 мил астроцитов средств массовой информации в 10 сантиметров фибронектин покрытием пластин, так что они около 10% слияния на следующий день. Культурные клетки при 37 градусах Цельсия в инкубаторе культуры тканей 5%CO2.
Изменение среды с 10 мил астроцитов средств массовой информации через три дня после покрытия. Держите клетки дифференциации в течение пяти-семи дней. Чтобы семена для экспериментов, разделить астроцитов с помощью трипсина или Accutase, как описано в шаге 2 до 2,6.
Рекомендуемая плотность посева включена во таблицу 2. Инструкции о том, как часть iNPCs для генерации индуцированных астроцитов расположены в таблице три. Чтобы сделать астроциты из замороженных запасов iNPC, удалите файл порций из резервуара для хранения жидкого азота и быстро оттаивать при 37 градусах по Цельсию.
Как только клетки размораживается, раствор пипетки в 15-мильной трубке, содержащей пять мил астроцитов. Центрифуга в течение четырех минут при комнатной температуре 200 Г. Удалить супернатант и повторное течение в один мил свежей среды астроцитов.
Добавьте девять мил свежих астроцитов среды к фибронектин покрытием 10 сантиметров блюдо и добавить один мил клеточный раствор, мягко распределяя клетки в северо-юго-юго-западном движении. Культурные клетки при 37 градусах Цельсия в инкубаторе культуры тканей 5%CO2. Этот протокол позволяет быстро и легко генерации iNPCs непосредственно из фибробластов кожи человека с использованием ретровирусов, содержащих факторы Яманака.
Этот метод позволяет обойти состояние стволовых клеток и необходимость клонального отбора, тем самым избегая клональных вариаций. Важные шаги, чтобы иметь в виду, в то время как клетки проходят процесс преобразования являются плотность посева фибробластов, рН мультимедиа, и сохранение клеток в оптимальном слиянии. Примеры оптимальных изменений слияния и морфологии в процессе преобразования можно найти в рисунке один.
После завершения процесса преобразования NPC будет показывать сильно уменьшенное выражение или отсутствие выражения фибробластов и морфологии и выражать маркеры клеток, специфичные для NPC. Кроме того, они также могут быть использованы для генерации различных клеточных линий, таких как индуцированные нейроны, олигодендроциты и астроциты. По нашему опыту, индуцированные астроциты, в частности, очень ценны для тестирования механизма наркотиков и болезней, поскольку они могут быть созданы в чистых популяциях в воспроизводимых больших количествах.
Индуцированные астроциты могут быть дифференцированы от iNPCs, принимая небольшую алициты клеток во время расщепления или ранее замороженные части iNPC и непосредственно покрытие в астроцитов средств массовой информации. Важными соображениями в ходе этого процесса являются поддержание первоначальной плотности посева iNPCs низкой, как высокая плотность посева было показано, препятствуют процессу дифференциации, и уделяя дополнительное внимание рН средств массовой информации, как подкисление может активировать даже здоровые астроциты. Таким образом, протокол прямого преобразования является очень быстрым методом, чтобы иметь возможность сделать нервные клетки-предшественники из образцов кожи пациента.
Это позволяет изучать большее количество образцов клеток в то же время и действительно смотреть на разнообразие в контексте болезни. Мы считаем, что это очень сильный анализ, который можно использовать, чтобы сделать нейронные клетки-предшественники, нейроны, но и астроциты, которые затем могут быть использованы либо в совместной культуре или сами по себе для тестирования на наркотики или механистических исследований, а также.
