我们使用此协议从患者皮肤成纤维细胞中制造神经祖细胞，并研究神经和神经退行性疾病。我们认为，与经典的IPS技术相比，此协议有很多优点，包括速度，但在某些情况下，还会获得更严重的疾病表型。我们研究神经和神经退行性疾病，使用皮肤样本使我们能够真正评估患者的多样性。
我的实验室对星形细胞在疾病中的作用特别感兴趣，我们使用我们从NPC中产生的星形细胞来测试药物，也研究疾病机制，同时也研究与人类和小鼠神经元的共生。我们希望此协议将翔实，如果您有任何问题，请联系。谢谢。
使用可从细胞库或皮肤活检中获取的原发性人类皮肤成纤维细胞。在 5% CO2 组织培养孵化器中培养 37 摄氏度的培养细胞。在实验中使用之前，至少一到两个通道的通道细胞在解冻后。
细胞准备好后，在室温下在PBS中稀释1：200浓度的六井板，涂上人类纤维素的井，时间为15至20分钟。准备图一中所示的成纤维细胞介质。当细胞准备镀时，从盘子中取出纤维素，并立即添加细胞溶液或两毫升成纤维细胞介质。
在添加介质之前，不要让盘子变干。根据细胞生长的速度，在两口井中，有15万到20万块成纤维细胞，这些纤维细胞是人体纤维素涂层的六井板。在 5% CO2 组织培养孵化器中培养 37 摄氏度的培养细胞。
播种后的第二天，检查显微镜下的成纤维细胞，并验证细胞密度在70%至85%之间，用所有四个逆转录病毒载体：Oct3/4、Klf4、Sox2和c-Myc。使用多种感染10为快速生长或15缓慢生长的成纤维细胞。每个向量的转导效率必须超过 70% 或更多正细胞。
将常规成纤维细胞介质添加到病毒混合物中，每口井的总容量为 1 密耳。将第二口井未经处理，将细胞返回组织培养孵化器，在一夜之间孵化。转导后的第二天，用 PBS 清洗细胞一次，并添加一密耳新鲜成纤维细胞介质。
在 5% CO2 组织培养孵化器中培养 37 摄氏度的培养细胞。第二天，准备转换介质，如表一所示，用PBS清洗细胞一次，以摆脱残留的成纤维细胞介质，然后添加一密耳的转换介质。将未经处理的介质也更改为转换介质。
观察显微镜下的细胞，观察形态的变化。在整个转换过程中，应每天更换一到两密耳的转换介质和随后的 iNPC 文化。通过小心地从井中去除 70% 的介质来改变介质，同时确保细胞仍然覆盖在剩余的 30% 介质中。
继续观察细胞，每天用一到两密耳的转换介质改变介质。在转换介质中大约五到六天后，或当细胞变得非常密集时，通过它们一到二或最多一到三个。加热 Accutase，在六井板中涂上适量的油井，在室温下在 PBS 中稀释 1：200，总纤维素为 15 至 20 分钟。
使用PBS小心地清洗细胞，而不会分离任何细胞。使用井壁轻轻地将 PBS 涂抹在细胞上。小心地用移液器或吸气去除 PBS。
加入500微升吸管，在37摄氏度的组织培养孵化器中孵化2至3分钟。在显微镜下检查，以验证大多数细胞是否已经分离。如果细胞脱落，加入两毫升的新鲜转化介质，轻轻上下吹笛两到三次，以分离团块。
将细胞收集在15密耳管中，并加入3个密耳介质，以进一步稀释阿库塔塞。在室温下200G下离心机4分钟。从细胞颗粒中取出超纳特，用一百万的新鲜介质重新注入细胞。
轻轻上下吹笛两到三次，以解决细胞团。从涂层的六口井中取出纤维素，并立即向每口井添加一个 mil 新鲜介质。对于 1：2 的分割比，在一口井中加入 500 微升的细胞悬浮，在第二口井中添加其他 500 微升。
通过在东西南北方向轻轻摇动六口井并放入37度组织培养孵化器来分配细胞。第二天观察显微镜下的细胞，用一到两毫升改变介质。每天更换介质，直到细胞准备再次分裂。
准备 NPC 媒体包含 FGF 在增加浓度没有EGF或肝素，如表一所示。在这种新的分裂中，在转化介质中播种一口细胞，在NPC介质中播种另一口细胞。每天用一到两百万的 NPC 媒体不断更换 incpc 的媒体。
根据表一准备星体细胞介质。为了从新鲜的iNPC中制造星形细胞，在10厘米的纤维素涂层板中直接在10密耳的天体细胞介质中播种iNPC，以便第二天它们大约10%的汇合度。在 5% CO2 组织培养孵化器中培养 37 摄氏度的培养细胞。
电镀三天后用 10 密耳的星体细胞介质改变介质。保持细胞分化五到七天。要播种进行实验，请使用第 2 步到 2.6 中描述的胰蛋白酶或 Accutase 分裂星形细胞。
建议的播种密度包含在表二中。关于如何分份 iNPC 以生成诱导星形细胞的说明位于表三中。要从冷冻的 iNPC 库存中分离出星形细胞，请从液氮储存罐中取出部分储存文件，并在 37 摄氏度下快速解冻。
细胞解冻后，在含有5密耳星介质的1500万管中，一旦移液器细胞溶液。在200G室温下离心机4分钟。去除超自然物，并在一个密耳新鲜的星体细胞介质中重新喷出。
在纤维素涂层的10厘米盘中加入9密耳新鲜的星体细胞介质，并加入一个密耳细胞溶液，在南北东西运动中轻轻分配细胞。在 5% CO2 组织培养孵化器中培养 37 摄氏度的培养细胞。该协议允许使用含有山中因子的逆转录病毒，直接从人的皮肤成纤维细胞中快速、轻松地生成 iNPC。
这种方法允许绕过干细胞状态和克隆选择的需要，从而避免克隆变异。细胞在转换过程中需要记住的重要步骤是成纤维细胞播种密度、介质 pH 值以及保持细胞的最佳组合。在图一中可以找到转换过程中最佳汇流和形态变化的示例。
转换过程完成后，NPC 将显示强烈减少的表达或没有成纤维细胞标记和形态的表达，并表达 NPC 特定的细胞标记。此外，它们还可用于生成不同的细胞系，如诱导神经元、寡头细胞和星形细胞。根据我们的经验，诱导星核细胞尤其对药物和疾病机制测试非常有价值，因为它们可以在可重复大量可重复的纯种群中产生。
诱导的星形细胞可以通过在分裂过程中或先前冻结的 iNPC 部分时采取少量细胞的细胞，并在星形细胞介质中直接电镀来与 iNPC 区分开来。在这个过程中，重要的考虑因素是保持 iNPC 的初始播种密度低，因为高播种密度已证明阻碍分化过程，并更加注意介质 pH，因为酸化甚至可以激活健康的星形细胞。总之，直接转换协议是一种非常快速的方法，能够从患者皮肤样本中制造神经祖细胞。
这允许同时研究更多的细胞样本，并真正研究疾病背景的多样性。我们觉得这是一个非常强大的检测，你可以用来制造神经祖细胞，神经元，但也星形细胞，然后可用于共同培养或自己用于药物测试或机械研究。
