Usamos este protocolo para fazer células progenitoras neurais de fibroblastos de pele do paciente e estudar doenças neurológicas e neurodegenerativas. Sentimos que este protocolo tem muitas vantagens sobre a tecnologia IPS clássica, incluindo a velocidade, mas também recebendo em certos casos um fenótipo de doença mais grave. Estudamos doenças neurológicas e neurodegenerativas e o uso de amostras de pele nos permite realmente avaliar a diversidade dos pacientes também.
Meu laboratório está particularmente interessado no papel dos astrócitos em doenças e usamos os astrócitos que fazemos dos NPCs para testar medicamentos e também para estudar mecanismos de doenças, mas também em co-culturas com neurônios humanos e camundongos. Esperamos que este protocolo seja informativo e, por favor, entre em contato se tiver alguma dúvida. Obrigado.
Use fibroblastos de pele humana primários que podem ser obtidos de bancos celulares ou biópsias de pele. Células de cultura a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecido de CO2 de 5%. Células de passagem para pelo menos uma a duas passagens após o descongelamento antes do uso no experimento.
Uma vez que as células estejam prontas, cubra um poço de uma placa de seis poços com fibronectina humana a uma concentração de 1:200 diluída em PBS à temperatura ambiente por 15 a 20 minutos. Prepare a mídia do fibroblasto, como mostrado na tabela um. Quando as células estiverem prontas para serem banhadas, remova a fibronectina do prato e adicione imediatamente a solução celular ou dois mil de mídia fibroblasto.
Não deixe o prato secar antes de adicionar mídia. Dependendo da rapidez com que as células crescem, placa 150.000 a 200.000 fibroblastos em dois poços de uma placa de seis poços revestidas de fibronectina humana. Células de cultura a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecido de CO2 de 5%.
No dia seguinte à semeadura, verifique os fibroblastos sob o microscópio e verifique se a densidade celular está entre 70 a 85% Transduce um bem com todos os quatro vetores retrovirais:Oct3/4, Klf4, Sox2 e c-Myc. Use uma multiplicidade de infecção de 10 para crescimento rápido ou 15 para fibroblastos de crescimento lento. A eficiência da transdução deve exceder 70% ou mais células positivas para cada vetor.
Adicione mistura regular de fibroblasto médio a viral para um volume total de um mil por poço. Deixe o segundo poço não tratado e devolva as células à incubadora da cultura tecidual para incubar durante a noite. No dia seguinte à transdução, lave as células uma vez com PBS e adicione um milhão de mídia de fibroblasto fresco.
Células de cultura a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecido de CO2 de 5%. No dia seguinte, prepare a mídia de conversão como mostrado na tabela um e lave as células uma vez com PBS para se livrar da mídia residual do fibroblasto, em seguida, adicione um mil de meio de conversão. Mude a mídia do poço não tratado para mídia de conversão também.
Observe células sob o microscópio e observe mudanças na morfologia. A mídia celular deve ser substituída diariamente durante todo o processo de conversão por um a dois mils de mídia de conversão e para a cultura subsequente do iNPC. Mude a mídia removendo cuidadosamente 70% da mídia do poço, certificando-se de que as células permaneçam cobertas nos 30% restantes da mídia.
Continue observando as células e mudando a mídia diariamente com um a dois mils de mídia de conversão. Depois de cerca de cinco a seis dias em mídia de conversão ou quando as células se tornam muito densas, passe-as de um a dois ou no máximo de um a três. Aqueça Accutase e cubra um número apropriado de poços em uma placa de seis poços com um mil fibronectina total diluída 1:200 em PBS por 15 a 20 minutos em temperatura ambiente.
Lave as células cuidadosamente com PBS sem separar nenhuma célula. Use a parede do poço para aplicar PBS suavemente nas células. Remova cuidadosamente o PBS com pipetas ou aspirando.
Adicione 500 microliters Accutase e incubar de dois a três minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura tecidual. Verifique sob o microscópio para verificar se a maioria das células se desprendeu. Se as células tiverem saído, adicione dois mil de mídia de conversão fresca e delicadamente pipeta para cima e para baixo duas a três vezes para dissociar aglomerados.
Colete as células em um tubo de 15 mil e adicione três mils de mídia para diluir ainda mais o Accutase. Centrífuga por quatro minutos a 200 G à temperatura ambiente. Remova o supernascedor da pelota celular e resuspense as células em um milhão de meio fresco.
Pipeta suavemente para cima e para baixo duas a três vezes para resolver aglomerados celulares. Remova a fibronectina de seis poços revestidos e adicione uma mídia fresca a cada poço imediatamente. Para uma proporção dividida de 1:2, adicione 500 microliters da suspensão celular em um poço e os outros 500 em um segundo bem.
Distribua as células agitando suavemente os seis poços na direção nordeste-oeste e coloque em incubadora de cultura tecidual de 37 graus. Observe as células sob o microscópio no dia seguinte e mude a mídia com um a dois mils. Mude a mídia todos os dias até que as células estejam prontas para serem divididas novamente.
Prepare as mídias NPC contendo FGF em maior concentração sem EGF ou heparina, como visto na tabela um. Nesta nova divisão, semente um poço de células em mídia de conversão e o outro bem na mídia NPC. Continue mudando a mídia dos iNPCs diariamente com um a dois mils de mídia NPC.
Prepare a mídia de astrócito de acordo com a tabela um. Para fazer astrócitos de iNPCs frescos, as iNPCs de sementes diretamente em 10 mil de mídia astrócito em placas revestidas de fibronectina de 10 centímetros para que estejam em torno de 10% de confluência no dia seguinte. Células de cultura a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecido de CO2 de 5%.
Mude de meio com 10 mils de mídia de astrócito três dias após o revestimento. Mantenha as células diferenciando por cinco a sete dias. Para a semente para experimentação, divida os astrócitos usando trippsina ou Accutase como descrito na etapa 2 a 2.6.
As densidades de semeadura recomendadas estão incluídas na tabela dois. Instruções sobre como porção iNPCs para gerar astrócitos induzidos estão localizadas na tabela três. Para fazer astrócitos a partir de estoques congelados iNPC, remova o arquivo de estoque de porção do tanque de armazenamento de nitrogênio líquido e descongele rapidamente a 37 graus Celsius.
Assim que as células são descongeladas, a solução de células pipetas em um tubo de 15 mil contendo cinco mil de mídia astrócito. Centrífuga por quatro minutos a 200 G de temperatura ambiente. Remova o supernatante e resuspend em um meio de astrócito fresco.
Adicione nove mil mil de meio astrócito fresco a um prato de 10 centímetros revestido de fibronectina e adicione uma solução de célula mil, distribuindo suavemente células em movimento nordeste-oeste. Células de cultura a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecido de CO2 de 5%. Este protocolo permite a geração rápida e fácil de iNPCs diretamente de fibroblastos de pele humana usando retrovírus contendo os fatores Yamanaka.
Este método permite contornar o estado das células-tronco e a necessidade de seleção clonal, evitando assim a variação clonal. Passos importantes a serem mantidos em mente enquanto as células estão passando pelo processo de conversão são a densidade de semeadura do fibroblasto, o pH da mídia e manter as células em uma confluência ideal. Exemplos de alterações ideais de confluência e morfologia durante o processo de conversão podem ser encontrados na figura um.
Após o processo de conversão ser concluído, os NPCs mostrarão expressão fortemente reduzida ou nenhuma expressão de marcadores de fibroblasto e morfologia e marcadores celulares específicos do NPC. Além disso, eles também podem ser usados para gerar diferentes linhas celulares, como neurônios induzidos, oligodendrócitos e astrócitos. Em nossa experiência, os astrócitos induzidos, em particular, são muito valiosos para testes de mecanismos de drogas e doenças, pois podem ser gerados em populações puras em grandes números reprodutíveis.
Os astrócitos induzidos podem ser diferenciados dos iNPCs tomando uma pequena alíquota de células durante a divisão ou uma porção de iNPC previamente congelada e diretamente emplacando em mídia de astrócito. Considerações importantes durante este processo são manter a densidade inicial de semeadura dos iNPCs baixa, pois uma alta densidade de semeadura tem sido demonstrada para dificultar o processo de diferenciação, e prestando atenção adicional ao pH da mídia, pois a acidificação pode ativar até mesmo astrócitos saudáveis. Em resumo, o protocolo de conversão direta é um método muito rápido para ser capaz de fazer células progenitoras neurais a partir de amostras de pele do paciente.
Isso permite estudar um número maior de amostras de células ao mesmo tempo e realmente olhar para a diversidade no contexto da doença. Achamos que este é um ensaio muito forte que você pode usar para fazer células progenitoras neurais, neurônios, mas também astrócitos que podem ser usados tanto na co-cultura quanto por eles mesmos para testes de drogas ou estudos mecanicistas também.
