Usiamo questo protocollo per creare cellule progenitrici neurali dai fibroblasti cutanei del paziente e studiare malattie neurologiche e neurodegenerative. Riteniamo che questo protocollo abbia molti vantaggi rispetto alla classica tecnologia IPS, compresa la velocità, ma anche ottenere in alcuni casi un fenotipo di malattia più grave. Studiamo malattie neurologiche e neurodegenerative e l'utilizzo di campioni cutanei ci consente davvero di valutare anche la diversità dei pazienti.
Il mio laboratorio è particolarmente interessato al ruolo degli astrociti nelle malattie e usiamo gli astrociti che facciamo dai PNG per testare i farmaci e anche per studiare i meccanismi delle malattie, ma anche nelle co-culture con i neuroni umani e dei topi. Speriamo che questo protocollo sia informativo e ti preghiamo di contattare se hai domande. Grazie.
Utilizzare fibroblasti cutanei umani primari che possono essere ottenuti da banche cellulari o biopsie cutanee. Cellule di coltura a 37 gradi Celsius in un incubatore di coltura tissutale 5%CO2. Cellule di passaggio per almeno uno o due passaggi dopo lo scongelamento prima dell'uso nell'esperimento.
Una volta che le cellule sono pronte, rivestire un pozzo di una piastra a sei porri con fibronectina umana a una concentrazione di 1:200 diluita in PBS a temperatura ambiente per 15-20 minuti. Preparare i supporti fibroblasti come mostrato nella tabella uno. Quando le cellule sono pronte per essere placcate, rimuovere la fibronectina dal piatto e aggiungere immediatamente la soluzione cellulare o due mils di mezzi fibroblasti.
Non lasciare asciugare il piatto prima di aggiungere mezzi. A seconda della velocità di crescita delle cellule, la piastra da 150.000 a 200.000 fibroblasti in due pozzi di una piastra a sei potta rivestita di fibronectina umana. Cellule di coltura a 37 gradi Celsius in un incubatore di coltura tissutale 5%CO2.
Il giorno dopo la semina, controllare i fibroblasti al microscopio e verificare che la densità cellulare sia compresa tra il 70 e l'85%Trasducirne un pozzo con tutti e quattro i vettori retrovirali:Oct3/4, Klf4, Sox2 e c-Myc. Utilizzare una molteplicità di infezione di 10 per la crescita rapida o 15 per i fibroblasti a crescita lenta. L'efficienza di trasduzione deve superare il 70% o più di cellule positive per ogni vettore.
Aggiungere un mix regolare di fibroblasti medio-virale per un volume totale di un mil per pozzo. Lasciare il secondo pozzo non trattato e riportare le cellule all'incubatore di coltura tissutale per incubare durante la notte. Il giorno dopo la trasduzione, lavare le cellule una volta con PBS e aggiungere un milione di mezzi fibroblasti freschi.
Cellule di coltura a 37 gradi Celsius in un incubatore di coltura tissutale 5%CO2. Il giorno successivo, preparare i supporti di conversione come mostrato nella tabella uno e lavare le cellule una volta con PBS per sbarazzarsi del mezzo fibroblasto residuo, quindi aggiungere un milione di mezzo di conversione. Cambia bene anche i supporti dei media non trattati in supporti di conversione.
Osserva le cellule al microscopio e osserva i cambiamenti nella morfologia. I supporti cellulari devono essere sostituiti giornalmente durante tutto il processo di conversione con uno o due milioni di supporti di conversione e per le successive impostazioni cultura iNPC. Modificare i supporti rimuovendo con attenzione il 70% dei supporti dal pozzo, assicurando al contempo che le celle rimangano coperte nel restante 30% dei supporti.
Continuare a osservare le celle e cambiare i supporti ogni giorno con uno o due milioni di supporti di conversione. Dopo circa cinque o sei giorni in mezzi di conversione o quando le cellule diventano molto dense, passare da uno a due o massimo da uno a tre. Riscaldare Accutase e rivestire un numero appropriato di pozzi in una piastra a sei porri con un milione di fibronectina totale diluita 1:200 in PBS per 15-20 minuti a temperatura ambiente.
Lavare accuratamente le celle con PBS senza staccare le cellule. Utilizzare la parete del pozzo per applicare delicatamente PBS alle cellule. Rimuovere con cura pbs con pipette o aspirando.
Aggiungere 500 microlitri Accutasi e incubare da due a tre minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore di coltura tissutale. Controllare al microscopio per verificare che la maggior parte delle cellule si sia staccata. Se le cellule si sono spente, aggiungere due milioni di nuovi mezzi di conversione e pipettare delicatamente su e giù da due a tre volte per dissociare i grumi.
Raccogliere le celle in un tubo da 15 mil e aggiungere tre mezzi mils per diluire ulteriormente l'Accutasie. Centrifugare per quattro minuti a 200 G a temperatura ambiente. Rimuovere il supernatante dal pellet cellulare e rimescolare le cellule in un milione di mezzo fresco.
Pipettare delicatamente su e giù da due a tre volte per risolvere i grumi cellulari. Rimuovere la fibronectina dai sei pozzali rivestiti e aggiungere immediatamente un milione di mezzi freschi a ciascuno. Per un rapporto di divisione di 1:2, aggiungere 500 microlitri della sospensione cellulare in un pozzo e gli altri 500 in un secondo pozzo.
Distribuire le cellule scuotendo delicatamente i sei pozzi in direzione nord-sud est-ovest e mettere in incubatrice di coltura tissutale a 37 gradi. Osservare le cellule al microscopio il giorno successivo e cambiare i supporti con uno o due mils. Cambiare supporto ogni giorno fino a quando le celle non sono pronte per essere divise di nuovo.
Preparare i supporti NPC contenenti FGF ad una maggiore concentrazione senza FEG o eparina come si vede nella tabella uno. A questa nuova divisione, seminare un pozzo di cellule nei supporti di conversione e l'altro bene nei supporti NPC. Continua a cambiare i supporti degli INPC ogni giorno con uno o due milioni di supporti NPC.
Preparare i supporti astrociti secondo la tabella uno. Per realizzare astrociti da iNPC freschi, seminare i NPC direttamente in 10 mils di mezzi di astrociti in piastre rivestite con fibronectina di 10 centimetri in modo che siano circa il 10% di confluenza il giorno seguente. Cellule di coltura a 37 gradi Celsius in un incubatore di coltura tissutale 5%CO2.
Cambiare mezzo con 10 mils di supporti astrociti tre giorni dopo la placcatura. Mantenere le celle differenzianti per cinque o sette giorni. Per seminare per la sperimentazione, dividere gli astrociti usando tripina o Accutasi come descritto nel passaggio da 2 a 2.6.
Le densità di semina raccomandate sono incluse nella tabella due. Le istruzioni su come porzionare gli INPC per generare astrociti indotti si trovano nella tabella tre. Per creare astrociti da scorte iNPC congelate, rimuovere il file di stock di porzioni dal serbatoio di stoccaggio dell'azoto liquido e scongelare rapidamente a 37 gradi Celsius.
Non appena le cellule vengono scongelate, la soluzione di cella della pipetta in un tubo da 15 mil contenente cinque mils di mezzi astrociti. Centrifugare per quattro minuti a temperatura ambiente di 200 G. Rimuovere il supernatante e resuspend in un mezzo di astrocita fresco da un milione.
Aggiungere nove mils di mezzo di astrocito fresco a un piatto di 10 centimetri rivestito di fibronectina e aggiungere una soluzione cellulare mil, distribuendo delicatamente le cellule nel movimento nord-sud est-ovest. Cellule di coltura a 37 gradi Celsius in un incubatore di coltura tissutale 5%CO2. Questo protocollo consente la rapida e facile generazione di iNPC direttamente dai fibroblasti della pelle umana utilizzando retrovirus contenenti i fattori Yamanaka.
Questo metodo consente di bypassare lo stato delle cellule staminali e la necessità di selezione clonale, evitando così variazioni clonali. Passaggi importanti da tenere a mente mentre le cellule sono sottoposte al processo di conversione sono la densità di semina dei fibroblasti, il pH del supporto e il mantenimento delle cellule a una confluenza ottimale. Esempi di cambiamenti ottimali di confluenza e morfologia durante il processo di conversione possono essere trovati nella figura uno.
Al termine del processo di conversione, i PNG mostreranno un'espressione fortemente ridotta o nessuna espressione di marcatori e morfologia dei fibroblasti e esprimeranno marcatori cellulari specifici dell'NPC. Inoltre, possono anche essere utilizzati per generare diverse linee cellulari come neuroni indotti, oligodendrociti e astrociti. Nella nostra esperienza, gli astrociti indotti in particolare sono molto preziosi per i test dei farmaci e dei meccanismo delle malattie in quanto possono essere generati in popolazioni pure in gran numero riproducibile.
Gli astrociti indotti possono essere differenziati dagli iNPC prendendo una piccola aliquota di cellule durante la scissione o una porzione iNPC precedentemente congelata e placcando direttamente nei mezzi astrociti. Considerazioni importanti durante questo processo sono il mantenimento della densità iniziale di semina degli INPC bassa, poiché è stata dimostrata un'elevata densità di semina per ostacolare il processo di differenziazione, e prestando ulteriore attenzione al pH dei media in quanto l'acidificazione può attivare anche astrociti sani. In sintesi, il protocollo di conversione diretta è un metodo molto rapido per essere in grado di creare cellule progenitrici neurali da campioni di pelle del paziente.
Ciò consente di studiare un maggior numero di campioni cellulari contemporaneamente e guardare davvero alla diversità nel contesto della malattia. Riteniamo che questo sia un saggio molto forte che si può usare per creare cellule progenitrici neurali, neuroni, ma anche astrociti che possono poi essere usati sia in co-coltura che da soli per test farmacologici o studi meccanicistici pure.
