سيحدد هذا البروتوكول طريقة سهلة وفعالة لعزل خلايا الظهارة المصطبغة في شبكية العين الأولية للفئران بنجاح. تلعب خلايا الظهارة المصطبغة بالشبكية دورا مهما للغاية للحفاظ على خلايا المستقبلات الضوئية وضمان الوظيفة الطبيعية للشبكية. يقوم مختبرنا بعزل خلايا ظهارة الفئران الأولية المصطبغة كأداة مهمة لدراسة حاجز الدم والشبكية الخارجي والأمراض ذات الصلة مثل التنكس البقعي المرتبط بالعمر.
لاستخراج عيون الفأر ، قم بالقتل الرحيم للفأر أخلاقيا وفقا للطرق المعتمدة لمؤسستك ، ثم ضع الماوس على وسادة سفلية معقمة وقم بنوى العين عن طريق الضغط على ملاقط على غرار 5/45 على المنطقة المدارية للحث على البروبتوسيس ، ثم حرك الملقط إلى الجزء الخلفي من العين واسحبه برفق لإزالة العين لضمان بقاء العصب البصري سليما. أثناء استخدام الملقط ، غمر العينين في أنبوب طرد مركزي دقيق 2 ملليلتر يحتوي على 5٪ من يود البوفيدون. احتضان العينين في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 إلى 3 دقائق.
إزالة العينين من اليود بوفيدون ووضعها في طبق بتري. أثناء استخدام ماصة نقل معقمة ، اغسل العينين بمحلول هانكس الملحي المتوازن حتى يختفي اللون البرتقالي ليود البوفيدون. هذا يستغرق ما يقرب من 2 إلى 3 غسلات.
ضع العينين في طبق بتري جديد واغمرهما في وسائط نمو خلايا RPE كاملة باردة. من هناك ، يمكنك البدء في تشريح تحت المجهر تشريح. تحت المجهر ، استخدم ملاقط و / أو مقص Vannas لسحب أو قطع النسيج الضام في العضلات خارج العين.
يمكن بعد ذلك الاحتفاظ بالعيون لمدة ساعة في وسائط زراعة خلايا RPE الباردة. ومع ذلك ، يفضل المتابعة مباشرة إلى الخطوة التالية بعد تنظيف مقلة العين. انقل العينين إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 ملليلتر يحتوي على محلول الإنزيم A ، ثم احتضن العينين داخل حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
قم بإزالة العينين من محلول الإنزيم A وضعهما في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 2 ملليلتر يحتوي على محلول الإنزيم B ، ثم ضعهما داخل حاضنة واحتضنهما عند 37 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة. إزالة العينين من إنزيم B ووضعهما في طبق بتري 60 ملم وغمرهما وإكمال وسائط نمو خلايا RPE ، ثم احتضان العينين عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. ضع الطبق تحت المجهر التشريحي وابدأ في التشريح.
استخدم ملقط M5S وإبرة حقنة لإجراء شق في قسم أورا سيراتا. الآن باستخدام ملقطين ، أمسك الجزء الداخلي من الشق بملقط واحد وأمسك القرنية بالملقط الآخر. ابدأ في تمزيق القرنية ببطء من شبكية العين عن طريق سحب القرنية.
تأكد من التمزق بزيادات صغيرة والتحرك لأسفل المسيل للدموع أثناء إزالة القرنية. سيضمن ذلك بقاء RPE سليما في الغالب وستحصل على تمزق أنظف. بمجرد فصل القرنية تماما ، يجب أن تكون قادرا على رؤية القزحية والعدسة.
قم بإزالة كل من القزحية والعدسة باستخدام الملقط للحفاظ على نقاء العزل. لإزالة شبكية العين العصبية من طبقة RPE ، أمسك الطبقة الخارجية من كأس العين باستخدام ملاقط واحدة وضع ذراع من ملاقط ثانية بين كل من RPE والطبقات العصبية. من هناك ، اسحب الشبكية العصبية بلطف أو اغرف بعيدا عن طبقة RPE ، ثم تخلص من الشبكية العصبية.
انقل طبقة RPE إلى مكان مختلف على الطبق الخالي من الحطام. لفصل RPE عن المشيمية والصلبة ، قم بكشط الجزء الداخلي من كأس العين بلطف باستخدام ملاقط على غرار 5/45 لضمان فصل خلايا RPE. تظهر خلايا RPE غائمة عند تعليق وإكمال وسائط نمو خلايا RPE.
قم بشفط الخلايا باستخدام ماصة نقل معقمة سعة 3.2 ملليلتر ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 ملليلتر يحتوي على وسائط نمو خلايا RPE كاملة. يمكن طرد الخلايا مركزيا عند 300 جرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يمكنك بعد ذلك شفط السوبرناتانت وإعادة تعليق الكريات في وسائط نمو خلايا RPE الدافئة.
ضعي الخلايا على طبق بتري عيار 100 ملم واحتضنيها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. تظهر هذه الصور عزلة ناجحة في الممر 0 والممر 1 ، وهو ما يتضح من خلال تصبغ خلايا RPE. في الممر 4 ، تصبح الخلايا أقل تميزا وتظهر صبغة أقل ، أو تظهر مظهرا يشبه المغزل أو تصبح أكثر قوة مع مساحة سطح أكبر.
لقد تحققنا من صحة خلايا RPE باستخدام علامة خاصة ب RPE ، RPE65 وبروتين الهيكل الخلوي F-actin. تحققنا أيضا من وجود تلوث محتمل بخلايا مولر عن طريق تلطيخ بعلامة خاصة بخلية مولر ، vimentin. هذا البروتوكول هو تكييف مبسط للبروتوكولات القائمة.
يستخدم البروتوكول المواد والمعدات المرتبطة بها المتوفرة في معظم مختبرات الأبحاث ، مما سيساعد على عزل خلايا RPE الأولية للفأر بطريقة فعالة.
