ظهارة الشبكية الصبغية أو RPE أمر بالغ الأهمية لصحة الشبكية. ودراسة RPE المعزولة أمر بالغ الأهمية لمرض الشبكية. تساعد طريقة عزل RPE هذه عن خنزير غينيا ، وهو نموذج قصر نظر شائع ، في حل المشكلة الصعبة.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بسيطة نسبيا وتنتج عينة RPE عالية الجودة مناسبة للدراسات الجزيئية البيولوجية بما في ذلك تحليل RPE. من خلال اتباع التقنية الموضحة بشكل مثالي ومراقبة كيفية التعامل مع أدوات التشريح ، يمكن للمرء إتقان هذا الإجراء بسرعة مع بعض الممارسة. بعد القتل الرحيم إنسانيا لخنزير غينيا واستئصال عيون الحيوان ، اغسل العينين على الفور عن طريق نقلها إلى طبق بتري 10 سم يحتوي على محلول ملحي معقم من الفوسفات أو PBS.
بعد الغسيل ، انقل العينين إلى محلول PBS جديد. الآن تحت المجهر التشريحي ، استخدم إبرة قياس 18 لعمل فتحة صغيرة أولية في الصلبة في عين واحدة ، حوالي ملليمتر واحد خلف الحدود الداكنة حول القزحية بين القرنية والصلبة. باستخدام المقص ، قم بإزالة الجزء الأمامي ، بما في ذلك القرنية والقزحية والجسم الهدبي والعدسة البلورية.
ثم العمل مع الجزء الخلفي المتبقي من العين ، استخدم الملقط للإمساك بمنطقة زين وسحبها برفق ، متبوعا بفصل الشبكية عن مجمع RPE / المشيمية / الصلبة ، وتقشير الشبكية دون تجزئة. بعد إزالة الشبكية بالكامل ، اغمر كوب العين الخلفي المتبقي ، والذي يتضمن RPE والمشيمية والصلبة في أحد آبار صفيحة 12 بئرا تحتوي على ملليلتر من كاشف تخزين الأنسجة واحتفظ بها مغمورة لمدة خمس دقائق. لشطف كاشف التخزين ، انقل كوب العين إلى بئر آخر مملوء بأربعة ملليلتر من PBS لمدة 10 ثوان قبل نقله إلى بئر ثالث مملوء بملليلتر من PBS.
قبل الانتقال إلى خطوة عزل RPE النهائية ، قم بإعداد حقنة سعة ملليلتر واحدة مملوءة ب PBS وقم بتوصيل إبرة قياس 30. اضغط برفق على مكبس المحقنة لإنشاء تيار نفاث من PBS. العمل تحت المجهر ، أولا ، استهدف هذا التيار من PBS في RPE لعمل تمزق صغير أو ثقب فيه.
ثم قم بتوجيه دفق PBS إلى الفتحة التي تم إنشاؤها لفصل RPE كورقة من المشيمية. بعد فصل RPE عن المشيمية ، اجمع خلايا RPE في حقنة ملليلتر واحدة عديمة الإبر وانقل العينة المجمعة إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. جهاز طرد مركزي الأنبوب باستخدام RPE الذي تم جمعه عند 8،000 × g لمدة دقيقة واحدة للحصول على حبيبات RPE.
بالنسبة للعينات التي سيتم استخدامها في تحليلات الحمض النووي الريبي ، تخلص من المادة الطافية ، أي محلول PBS ، واستبدلها ب 350 ملليلتر من محلول التحلل كما هو مدرج في مجموعات عزل الحمض النووي الريبي. قم بسحب المحتوى لأعلى ولأسفل 20 مرة لخلطه جيدا والحفاظ على جودة العينة. للتخزين والحفظ على المدى الطويل ، انقل العينات إلى مجمد بدرجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر.
استخدم مجموعة عزل الحمض النووي الريبي واتبع تعليمات الشركة المصنعة لعزل وجمع الحمض النووي الريبي من عينات RPE قبل تقييم جودة العينة عن طريق الرحلان الكهربائي. في دراستنا ، أظهرت عينات RPE التي تم جمعها الحمض النووي الريبي المحفوظ جيدا والذي يحتوي على رقم سلامة الحمض النووي الريبي أو RIN أكبر من ثمانية. إجمالي عدد الحمض النووي الريبي حوالي 240 نانوجرام لكل عين.
وجد أن مستوى التعبير للجين المحدد RPE ، Rpe65 ، أعلى بكثير في عينات RPE منه في المشيمية والصلبة. في المقابل ، أظهرت عينات RPE الحد الأدنى من التعبير عن الجين المحدد للصلبة المشيمية المختارة ، نوع الكولاجين ألفا واحد ، مما يشير إلى عدم وجود ملوثات المشيمية والصلبة في عينات RPE المعزولة. أهم خطوة في الإجراء هي الإزالة السلسة لشبكية العين دون ترك أي جزء من الشبكية.
يستدعي إجراء عزل RPE هذا شرحا في دراسات زراعة الخلايا في المختبر مع بعض الاختلافات المهمة ، بما في ذلك اختيار الوسائط لغمر خلايا RPE بعد العزل.
