فهم فعالية الأدوية في النماذج الحيوانية هو التكلفة والعمالة الكثيفة. بروتوكولنا الذي يستخدم نموذج اكسبلانت الأنسجة الحية هو أقل بكثير سواء من حيث التكلفة والأفراد العلميين اللازمة لإجراء الدراسة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي استخدام عيون البورسين ، والتي لها تشريح وعلم وظائف الأعضاء مشابهة جدا للعيون البشرية بدلا من بعض النماذج الحيوانية الصغيرة الأخرى.
عندما نختبر الأدوية في المختبر، قد تظهر فعالية قد تكون غائبة في النماذج الحيوانية أو البشرية. نظم الأنسجة الحية السابقة هي أفضل طريقة لفهم ما إذا كان يمكن ترجمة أنظمتنا في المختبر إلى تجارب على الحيوانات والبشر. نظام القرنية porcine، على الرغم من أن أقل كثافة في اليد العاملة، يتطلب مهارات قابلة للتدريب لعزل وصيانة وتصيب وعلاج مع المخدرات، وخاصة عملية عزل القرنية من العين porcine كامل صعبة للتعبير في الكلمات، ولكن يتطلب مظاهرة بصرية.
عند تلقي عيون porcine من بائع مناسب ، قم بتخزين الأنسجة على الجليد حتى المعالجة ووضع معدات الحماية الشخصية المناسبة. تطهير منطقة العمل مع 70٪ الإيثانول وتأمين غطاء مقاعد البدلاء على مساحة العمل. عندما تكون منطقة العمل جاهزة، ضع العينين على قطعة من الشاش 50 ملليمتر واستخدم الشاش لفهم القسم الخلفي بيد واحدة.
باستخدام إبرة قياس 30، وجعل بعناية ثقب واحد في ما يقرب من مركز السطح الظهاري للعين، مع الحرص على عدم تلف ستروما، واستخدام شفرة معقمة حادة لجعل شق صغير على تصلب على مسافة ملليمتر واحد من القرنية. باستخدام عمل سريع وسلس الدورية من ناحية والحرص على أن الفكاهة الزجاجية لا تسرب، وقطع حافة القرنية وعقد القرنية على حافة القرنية- تصلب مع ملاقط مسطحة، واستخدام شفرة لقطع الأغشية الربط المتبقية. كما يتم عزل كل قرنية، ضع الأنسجة تواجه في الآبار الفردية من لوحة 12 بئرا تحتوي على اثنين من ملليلتر من القرنية المتوسطة لكل بئر وإضافة خمسة ميكرولتر من خمسة أضعاف 10 إلى وحدة تشكيل البلاك الخامسة من محلول فيروس GFP 17 إلى الموقع الحطام على كل سطح القرنية.
عندما يتم جمع جميع القرنيات، ضع الطبق في درجة حرارة 37 درجة مئوية، وحاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ لمدة 72 ساعة ورش أي عيون إضافية لم تستخدم في التجربة مع تبييض 10٪ للتخلص منها بشكل آمن في أكياس الخطر البيولوجي. كل يوم قبل إضافة الأدوية، ضع طبق القرنيات تحت مجهر ستيريو وحدد فلتر GFP ووقت التعرض 500 ميكروثانية. التقاط الصور في أدنى التكبير قبل تصوير القرنيات في سلسلة من التكبير المتزايد حتى يمكن تصور كل من انتشار الفيروسية وتشكيل التشعب بوضوح.
عندما يتم تصوير جميع القرنيات، أعد الطبق إلى حاضنة زراعة الأنسجة. في اليوم السابق للعدوى، اغسل زراعة خلايا vero التقاء مرتين مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني لكل غسل، وعلاج الخلايا مع ملليلتر واحد من 0.05٪ تريبسين لكل بئر لمدة خمس إلى 10 دقائق في 37 درجة مئوية. عندما تكون الخلايا قد انفصلت، استخدم تسعة ملليلترات من الوسط الكامل لضمان إزاحة الخلايا تماما من سطح القارورة ونقل تعليق الخلية الناتج إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر.
إضافة 300 ميكرولتر من الخلايا إلى كل بئر من لوحة جديدة من ستة جيدا، تليها إضافة اثنين من ملليلتر من المتوسطة إلى كل بئر، ثم وضع لوحة في حاضنة ثقافة الخلية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، لجمع الفيروس من كل قرنية للقياس الكمي، نقع نصائح مسحة القطن العقيمة في 500 ميكرولتر من المتوسط الخالي من المصل لكل مسحة في أنابيب الطرد الدقيق متعددة في خزانة السلامة البيولوجية لمدة خمس دقائق على الأقل. في نهاية الحضانة، ضع بعناية ثقافات القرنية البرسينية المصابة في الخزانة.
باستخدام مسحات القطن الرطب، وجعل ثلاث ثورات في اتجاه عقارب الساعة وثلاث ثورات عكس اتجاه عقارب الساعة خمسة ملليمترات من وسط كل قرنية porcine المصابة دون تطبيق الضغط المفرط. في نهاية سلسلة من الثورات، تدوير كل مسحة في المتوسط الخالي من المصل شغل أنبوب الطرد الدقيق في اتجاه عقارب الساعة وعكس عقارب الساعة خمس مرات قبل قطع مسحات بحيث تناسب نصائح داخل كل أنبوب مع غطاء مغلق. عندما يتم مسح جميع القرنيات ، دوامة الأنابيب بسرعة عالية لمدة دقيقة واحدة.
لتحديد كمية الفيروس التي تم جمعها من كل قرنية، قم بإعداد تخفيف log10 مرة واحدة من الفيروس في المتوسط الخالي من المصل في أنابيب الطرد المركزي الدقيق حتى يتم الوصول إلى تخفيف مرة واحدة من 10 إلى ثمانية سالبة. بعد قرصنة متوسط النمو من كل بئر من الخلايا ، قم بنقل ملليلتر واحد من كل تخفيف فيروس بدءا من مرة واحدة 10 إلى ثلاثة سالبة إلى أحاديات الخلية المطلية ووضع الخلايا المصابة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة ساعتين. في نهاية الحضانة ، اغسل كل بئر بلطف مرتين مع PBS قبل إضافة ملليلترين من وسيطة محملة بالميثيلسليلوز إلى كل بئر لاحتضان لمدة 72 ساعة أو حتى يمكن ملاحظة تكوين لويحات.
عند مراقبة البلاك، أضف ببطء ملليلتر واحد من الميثانول إلى زاوية كل بئر لاحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، يستنشق ببطء محتويات كل بئر دون إزعاج أحادي الخلية. بعد ذلك ، تسمية كل بئر مع ملليلتر واحد من محلول العمل البنفسجي البلوري ، مع الحرص على تغطية جميع الخلايا لاحتضان لمدة 30 دقيقة محمية من الضوء.
في نهاية الحضانة ، تجاهل المحلول وتجفيف الآبار على ورقة ماصة ، ثم عد عدد اللويحات في أعلى تخفيف جيد لتحديد إجمالي محتوى الفيروس في محلول البداية ثلاث مرات. وكما لوحظ في تحليل التصوير المجسم المفلور، فإن الفعالية المضادة للفيروسات ل BX795 مماثلة لفعالية TFT في السيطرة على الانتشار الفيروسي، في حين أن القرنيات المعالجة بالمركبة لا تثبت انتشار الفيروس إلا من منطقة العدوى المركزية إلى المحيط بستة أيام بعد التلقيح الفيروسي الأولي. وبالمثل، فإن مسحات العين التي اتخذت في اليومين الثاني والرابع بعد العدوى تظهر تثبيط كامل للفيروس في العينات الإيجابية للسيطرة والعينات المعالجة BX795، في حين لوحظت زيادة حادة في ترتي الفيروس المعدي في عينات المكافحة السلبية.
عزل القرنية porcine من العين porcine كله هو أهم خطوة. والخطوات من 2-3 إلى 2-6 هي الأكثر أهمية في هذه العملية. ويمكن استخدام نموذجنا لفهم الانتشار التشجر للفيروس في القرنيات البورسينية.
ويمكن توسيع نطاق هذه الطريقة نحو الالتهابات البكتيرية والفطرية كذلك. وقد ساعدت هذه الطريقة في تصور انتشار الفيروس في القرنيات خارج نموذج الإنسان. هذا النموذج مفيد في اختبار فعالية الأدوية قبل التحرك نحو التجارب على الحيوانات والبشر.
