نشكر بيتر Staeheli لتوفير الفئران B6.A2G-MX1 وسيمرا أوتشيليك للحصول على المشورة الفنية. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية من خلال SFB829 وKN536 / 16، وكولن فورتشن برنامج / كلية الطب، جامعة كولونيا.

بيان الأخلاق. ويتم إعداد ورقة البشرة من الأضاحي وفقا صارم مع توصيات الدليل من Landesamt FÜR الناطور، UMWELT وVerbraucherschutz، Northrhine وستفاليا (ألمانيا). وتمت الموافقة على الدراسة من قبل LANUV NRW (عدد 8.84-02.05.20.13.018). 1. إعداد أدوات والثقافة وسائل الإعلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة أوراق البشرة في المتوسط ​​تعديل النسر Dulbecco ولل(DMEM) / الجلوكوز المرتفعة تحتوي على ثنائي الببتيد الجلوتامين، و 10٪ FCS، و 100 وحدة دولية / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين (المشار إليها فيما يلي باسم &quot;DMEM&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد ورقة البشرة، حل بعناية dispase II مسحوق (5 ملغ / مل) في برنامج تلفزيوني ساخنة (تصل إلى 37 درجة مئوية). مرشح الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرون واستخدامها مباشرة لتلقي العلاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد البشرة كلها يتصاعد 13، وإعداد حجب برتقاليإيه مع 0.5٪ مسحوق الحليب، 0.25٪ الجيلاتين من جلد أسماك المياه الباردة و 0.5٪ تريتون X-100 في TBS. السماح المواد بحل التي يحتضنها الخليط لمدة لا تقل عن 2 ساعة على RT على خلاط الدورية. إعداد أيضا 0.2٪ توين 20 في برنامج تلفزيوني كما غسل العازلة. لتثبيت وإعداد 3.4٪ و 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالمناعية من cryosections، وإعداد عازلة تمنع مع 5٪ مصل الماعز العادي و 0.2٪ توين 20 في برنامج تلفزيوني. لتثبيت وإعداد 0.5٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني. </li></ol> 2. إعداد صحائف البشرة من الجلد الفئران <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد البشرة من الجلد الخلفي الوليد للدراسات العدوى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس مقطوعة الرأس (بعد 1-3 أيام من ولادته) في طبق تشريح وقطع الأطراف والذيل على مقربة من الجذع للسماح إزالة فعالة من الجلد من الجذع كاملة. خلال إزالة الحدود القصوى، في محاولة للحفاظ على تخفيضات صغيرة قدر الإمكان في القطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الجذع مع منحني ملقط غرامة لND تحرك بلطف مقص طرف حادة تحت الجلد من الجمجمة لالذيلية على طول الظهر لفصل الجلد من الجذع. شق الجلد على طول الظهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل FACS وعزل الخلايا الكيراتينية أو إعداد RNA، تقشر الجلد الكامل من الجذع باستخدام ملقط لإصلاح الأنسجة ومقص طرف حادة لدفع قبالة الجذع. لإعداد cryosections أو يتصاعد كلها تأخذ قطعة فقط من الجلد مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم الجلد مرة أخرى مع مشرط إلى 1-2 قطع من حوالي 10 × 10 مم. وضع القطع في بئر واحدة من لوحة 6 جيدا مع ~ 1 مل PBS العقيمة. تأكد من أن الجانب الجلد يواجه القاع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال PBS بنسبة 1.5 مل dispase الثاني (5 ملغ / مل PBS) واحتضان لمدة 30 دقيقة إما في 37 ° C (ليتصاعد كلها) أو O / N عند 4 درجات مئوية. يغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. بلطف إزالة البشرة كما ورقة سليمة باستخدام ملقط واحد لإصلاح الأدمة الكامنة وملقط أخرى لرفع البشرة. استخدام مجهر لجعل هذه الخطوة EASذ. نقل ورقة البشرة في DMEM مع الجانب القاعدي نحو القاع. استخدام الأوراق على الفور لإجراء التجارب العدوى. ملاحظة: استخدم إعداد البشرة من الجلد حديثي الولادة أساسا لتحليل FACS وعزل الخلايا الكيراتينية أو إعداد RNA. بسبب هشاشته، وإعداد الأوراق المصابة لcryosections أو يتصاعد كله هو أقل ملاءمة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد البشرة من الجلد الذيل الكبار للدراسات العدوى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفئران في سن 1-3 أشهر من قبل خلع عنق الرحم. اتخاذ الذيل بدلا من الجلد مرة أخرى منذ فترة طويلة جزءا لا يتجزأ من بصيلات الشعر على ظهر تعيق فصل صفائح البشرة سليمة. قطع الذيل من الفئران ضحوا وشق عليه بالطول مع مشرط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقشر الجلد من العظام وختم عليها مع مشرط إلى قطع حوالي 5 × 5 مم. وضع ما يصل إلى 4 قطع في بئر واحدة والمضي قدما في الحضانة في dispase الثاني كما هو موضح تحت 2.1.5 ملاحظة: استخدام تاي الكبارل الجلد لإعداد cryosections أو يتصاعد كلها. بدلا من ذلك إلى استخدام الفوري، والذيول ويمكن تخزين أو نقل ما يقرب من 24 ساعة في 4 درجات مئوية دون أن تفقد كفاءة عدوى كبيرة. إذا كان يتم الاحتفاظ ذيول ما يصل إلى 48 ساعة، وصحائف البشرة يمكن بالكاد المصابين HSV-1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفكك البشرة لتحليل FACS ملاحظة: الكشف عن سطح بروتين تعبير عن طريق التحليل FACS تتطلب تقنيات تفارق الخلية المناسبة التي لا تضر سطح الخلية وبروتين من الفائدة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان أوراق البشرة الأطفال حديثي الولادة في لوحة 6 جيدا مع الجانب القاعدي على 1.5 مل / المؤتلف كذلك حل تفكك خلية القائم على التربسين لمدة 15 دقيقة في RT ولمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف حضانة بإضافة 3 مل DMEM. فصل الخلايا القرنية باستخدام ملقط غرامة منحني للتحرك بلطف البشرة في لوحة 6 جيدا بحيث تحصل على حل الكيراتينية. جمع تعليق خلية وكرر هذه الخطوة 3 مراتدائما استخدام DMEM جديدة. ملاحظة: هذا الإجراء التفكك هو المناسب للكشف عن nectin-1 على سطح القرنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، واحتضان الأوراق البشرة على حل تفكك خلية خالية من إنزيم (CDS) لمدة 15 دقيقة في RT و 15 دقيقة عند 37 ° C. احتضان 15 دقيقة أخرى في RT لطرد بلطف خارج الخلايا الكيراتينية قبل pipetting CDS صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع تعليق خلية وكرر الخطوة التنظيف 3 مرات باستخدام DMEM جديدة. ملاحظة: هذا التفكك هو مناسبة للكشف عن التعبير سطح HVEM. العيب من الحل CDS هو أن أقل من الخلايا يتم فصلها من المؤتلف مع الحل تفارق الخلية على أساس التربسين. بالإضافة إلى السطح التعبير، وحرية التعبير النووي أو حشوية مثل ICP0 التعبير يمكن تحليلها من قبل FACS بعد تفكك الأوراق البشرة المصابة مع المؤتلف حل تفكك خلية القائم على التربسين. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفكك البشرة لعزل الخلايا الكيراتينية أو السابقينالمسالك RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ورقة البشرة الأطفال حديثي الولادة في لوحة 6 جيدا مع الجانب القاعدي نحو قاع الطبق الذي يحتوي على 1.5 مل / المؤتلف كذلك حل تفكك خلية القائم على التربسين. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT. إضافة 3 مل DMEM وفصل الخلايا القرنية باستخدام ملقط غرامة منحني للتحرك بلطف البشرة في الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع تعليق خلية وكرر هذه الخطوة 3 مرات باستخدام DMEM جديدة. استخدام هذا التعليق الخلية لاستخراج الحمض النووي الريبي أو الثقافة الابتدائية الخلايا الكيراتينية الفئران. </li></ol></li></ol> 3. العدوى من صفائح البشرة مع HSV-1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل HSV-1 وزن السلالة 17 11 في ما لا يقل عن 500 ميكرولتر DMEM واستبدالها المتوسطة من حل الفيروس الذي الأوراق البشرة تطفو. وتعرف هذه النقطة الوقت كوقت 0 12. نفذ إصابة ورقة البشرة في بئر واحدة من 24 لوحة جيدا عند 37 درجة مئوية. ويستند حساب عيار الفيروس على العدد التقديريمن الخلايا في الطبقة القاعدية لكل ورقة البشرة (حوالي 2 × 10 5 خلايا لكل ورقة 5 × 5 مم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصيب مع HSV-1 في حوالي 100 وحدة لوحة تشكيل (PFU) / الخلية واستبدال المتوسطة التي تحتوي على الفيروس عن طريق DMEM في 1 ساعة بي ملاحظة: في حالة ورقة البشرة من الجلد حديثي الولادة، ونأخذ في الاعتبار أن ورقة تبدأ في فصل أثناء الحضانة. </li></ol> 4. التصور من الخلايا المصابة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتصاعد البشرة الجامع 13 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح ورقة البشرة مع 3.4٪ الفورمالديهايد إما لمدة 2 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجات مئوية. يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني ومنع مع 0.5٪ مسحوق الحليب، 0.25٪ الجيلاتين من جلد أسماك المياه الباردة و 0.5٪ تريتون X-100 في TBS لمدة 1 ساعة على RT 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأوراق O / N مع الماوس مكافحة ICP0 (الأجسام المضادة أحادية المنشأ 11060) 15 المخفف 1:60 في عرقلة العازلة في RT. لتصور شبكة خيوط المتوسطة احتضان في وقت واحد مع الأرنب بولكلونل مكافحةالماوس الكيراتين 14 (100 نانوغرام / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل 4-5 مرات مع PBS 0.2٪ توين 20 خلال 4 ساعة على RT. احتضان O / N مع AF488 مترافق مكافحة الفأر مفتش (1 ميكروغرام / مل)،-AF555 مترافق مفتش المضادة للأرنب (1 ميكروغرام / مل)، ودابي (4، 6-diamidino-2-phenylindole) (100 نانوغرام / مل) في عرقلة العازلة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مع PBS 0.2٪ توين 20 لمدة 4 ساعة على RT. ورقة البشرة جبل مع الجانب القاعدي على أعلى شريحة العينة، تغرس في الفلورسنت المتوسطة المتزايدة وتغطي مع coverslips. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البشرة Cryosections <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كانت ثابتة ورقة البشرة الكبار في 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في RT وغسلها 2 مرات مع برنامج تلفزيوني. تضمين ورقة ثابتة في الأنسجة تجميد المتوسطة وتجميد في النيتروجين السائل. قطع 8-10 ميكرون المقاطع مع cryomicrotome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الأجزاء مرة أخرى مع 0.5٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في RT، وغسل 2 مرات مع برنامج تلفزيوني، كتلة مع 5٪ مصل الماعز العادي و 0.2٪ توين 20 في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في RT، ثم وصمة عار لمدة 60 دقيقة مع م[أوس] مكافحة ICP0 (الأجسام المضادة أحادية المنشأ 11060) 15 المخفف 1:60 في عرقلة العازلة، تليها 3 مرات غسل مع العازلة حظر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم احتضان مع AF488 مترافق مكافحة الفأر مفتش (1 ميكروغرام / مل) ودابي (100 نانوغرام / مل) في عرقلة العازلة لمدة 45 دقيقة في RT ويغسل 3 مرات. تضمين المقاطع في الفلورسنت المتوسطة المتزايدة، وتغطي مع coverslips. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Koelle, D. M., Corey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex:+insights+on+pathogenesis+and+possible+vaccines.">Herpes simplex: insights on pathogenesis and possible vaccines.</a> Annu. Rev. Med. 59, 381-395 (2013).</li><li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+Viruses.">Herpes simplex Viruses.</a> Fields Virology. , 1823-1897 (2013).</li><li>Syrj&#228;nen, S., Mikola, H., Nyk&#228;nen, M., Hukkanen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+establishment+of+lytic+and+nonproductive+infection+by+herpes+simplex+virus+type+1+in+three-dimensional+keratinocyte+culture.">In vitro establishment of lytic and nonproductive infection by herpes simplex virus type 1 in three-dimensional keratinocyte culture.</a> J. Virol. 70, 6524-6528 (1996).</li><li>Visalli, R. J., Courtney, R. J., Meyers, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+and+replication+of+herpes+simplex+virus+type+1+in+an+organotypic+epithelial+culture+system.">Infection and replication of herpes simplex virus type 1 in an organotypic epithelial culture system.</a> Virology. 230, 236-243 (1997).</li><li>Hukkanen, V., Mikola, H., Nyk&#228;nen, M., Syrj&#228;nen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+infection+has+two+separate+modes+of+spread+in+three-dimensional+keratinocyte+culture.">Herpes simplex virus type 1 infection has two separate modes of spread in three-dimensional keratinocyte culture.</a> J. Gen. Virol. 80, 2149-2155 (1999).</li><li>Gescher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+viral+adsorption+and+penetration+by+an+aqueous+extract+from+Rhododendron+ferrugineum+L.+as+antiviral+principle+against+herpes+simplex+virus+type-1.">Inhibition of viral adsorption and penetration by an aqueous extract from Rhododendron ferrugineum L. as antiviral principle against herpes simplex virus type-1.</a> Antiviral Res. 82, 408-413 (2010).</li><li>Petermann, P., Haase, I., Knebel-M&#246;rsdorf, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Rac1+and+Cdc42+signaling+during+early+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+keratinocytes.">Impact of Rac1 and Cdc42 signaling during early herpes simplex virus type 1 infection of keratinocytes.</a> J. Virol. 83, 9759-9772 (2009).</li><li>Everett, R. D., Maul, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+IE+protein+Vmw110+causes+redistribution+of+PML.">HSV-1 IE protein Vmw110 causes redistribution of PML.</a> EMBO J. 13, 5062-5069 (1994).</li><li>Chrostek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+is+crucial+for+hair+follicle+integrity+but+is+not+essential+for+maintenance+of+the+epidermis.">Rac1 is crucial for hair follicle integrity but is not essential for maintenance of the epidermis.</a> Mol. Cell. Biol. 26, 6957-6970 (2006).</li><li>Petermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+mechanisms+of+Herpes+Simplex+Virus+Type+1+into+murine+epidermis:+Involvement+of+nectin-1+and+HVEM+as+cellular+receptors.">Entry mechanisms of Herpes Simplex Virus Type 1 into murine epidermis: Involvement of nectin-1 and HVEM as cellular receptors.</a> J. Virol. 89, 262-274 (2015).</li><li>McGeoch, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+DNA+sequence+of+the+long+unique+region+in+the+genome+of+herpes+simplex+virus+type+1.">The complete DNA sequence of the long unique region in the genome of herpes simplex virus type 1.</a> J. Gen. Virol. 69, 1531-1574 (1988).</li><li>Schelhaas, M., Jansen, M., Haase, I., Knebel-M&#246;rsdorf, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+exhibits+a+tropism+for+basal+entry+in+polarized+epithelial+cells.">Herpes simplex virus type 1 exhibits a tropism for basal entry in polarized epithelial cells.</a> J. Gen. Virol. 84, 2473-2484 (2003).</li><li>Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment:+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis.">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130, 5241-5255 (2003).</li><li>Rahn, E., Petermann, P., Hsu, M. J., Rixon, F. J., Knebel-M&#246;rsdorf, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+pathways+of+herpes+simplex+virus+type+1+into+human+keratinocytes+are+dynamin-+and+cholesterol-dependent.">Entry pathways of herpes simplex virus type 1 into human keratinocytes are dynamin- and cholesterol-dependent.</a> PLoS One. 6, e25464 (2011).</li><li>Everett, R. D., Cross, A., Orr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+truncated+form+of+herpes+simplex+virus+type+1+immediate-early+protein+Vmw110+is+expressed+in+a+cell+type+dependent+manner.">A truncated form of herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 is expressed in a cell type dependent manner.</a> Virology. 197, 751-756 (1993).</li><li>Horisberger, M. A., Staeheli, P., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+induces+a+unique+protein+in+mouse+cells+bearing+a+gene+for+resistance+to+influenza+virus.">Interferon induces a unique protein in mouse cells bearing a gene for resistance to influenza virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 1910-1914 (1983).</li><li>Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cyclodextrins+for+manipulating+cellular+cholesterol+content.">Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content.</a> J. Lipid Res. 38, 2264-2272 (1997).</li><li>Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cholesterol+depletion+by+cyclodextrin+on+the+sphingolipid+microdomains+of+the+plasma+membrane.">Effects of cholesterol depletion by cyclodextrin on the sphingolipid microdomains of the plasma membrane.</a> Biochem. J. 335, 433-440 (1998).</li><li>Yancey, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+cholesterol+efflux+mediated+by+cyclodextrins:+Demonstration+of+kinetic+pools+and+mechanism+of+efflux.">Cellular cholesterol efflux mediated by cyclodextrins: Demonstration of kinetic pools and mechanism of efflux.</a> J. Biol. Chem. 271, 16026-16034 (1996).</li><li>Montgomery, R. I., Warner, M. S., Lum, B. J., Spear, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus-1+entry+into+cells+mediated+by+a+novel+member+of+the+TNF/NGF+receptor+family.">Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family.</a> Cell. 87, 427-436 (1996).</li><li>Geraghty, R. J., Krummenacher, C., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Spear, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+of+alphaherpesviruses+mediated+by+poliovirus+receptor-related+protein+1+and+poliovirus+receptor.">Entry of alphaherpesviruses mediated by poliovirus receptor-related protein 1 and poliovirus receptor.</a> Science. 280, 1618-1620 (1998).</li><li>Taylor, J. M., Lin, E., Susmarski, N., Yoon, M., Zago, A., Ware, C. F., Pfeffer, K., Miyoshi, J., Takai, Y., Spear, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+entry+receptors+for+herpes+simplex+virus+and+their+roles+in+disease.">Alternative entry receptors for herpes simplex virus and their roles in disease.</a> Cell Host Microbe. 2, 19-28 (2007).</li><li>Barron, M. J., Brookes, S. J., Draper, C. E., Garrod, D., Kirkham, J., Shore, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+adhesion+molecule+nectin-1+is+critical+for+normal+enamel+formation+in+mice.">The cell adhesion molecule nectin-1 is critical for normal enamel formation in mice.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 3509-3520 (2008).</li><li>Wang, Y., Subudhi, S. K., Anders, R. A., Lo, J., Sun, Y., Blink, S., Wang, Y., Liu, X., Mink, K., Degrandi, D., Pfeffer, K., Fu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+herpesvirus+entry+mediator+as+a+negative+regulator+of+T+cell-mediated+responses.">The role of herpesvirus entry mediator as a negative regulator of T cell-mediated responses.</a> J. Clin. Invest. 115, 711-717 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

عندما تصاب أوراق البشرة من الجلد للبالغين من C57BL / 6 مع HSV-1 في حوالي 100 PFU / خلية، نلاحظ العدوى في كل ما يقرب من خلايا الطبقة القاعدية في البشرة البيني في حين ترتبط أقل جرعة الفيروس بخلايا أقل المصابة وأبطأ التقدم للعدوى. بشكل عام، تظهر بصيلات الشعر على عدد متغير من الخلاي...

فيروس الهربس البسيط (HSV) يمكن أن تسبب مجموعة من الأمراض لدى البشر من آفات جلدية مخاطية غير معقدة خفيفة للعدوى تهدد الحياة. نوع HSV 1 (HSV-1) يرتبط بصورة شائعة مع التهابات فموي وجهي والتهاب الدماغ، في حين HSV نوع 2 (HSV-2) أكثر عرضة يسبب الالتهابات التناسلية 1. في حين أن هناك تقدما كبيرا في فهم كيف يدخل HSV الخلايا في الثقافة، ويبدأ العدوى وينتج ذرية الفيروسية، ونحن نعرف القليل عن مسار الفيروسي الغزو (ق) في الأنسجة على المستوى الخلوي 2. للدراسات HSV الجلد أو التهابات الغشاء المخاطي، والفئران، وقد استخدمت الأرانب والخنازير الغينية كما النماذج الحيوانية. تأسست عدوى الجلد عن طريق الحقن داخل الأدمة أو خدش الجلد في وجود فيروس، وارتبط تطور المرض مع إنتاج فيروس. هذه الأساليب ساعدت على فهم الجوانب المختلفة لإمراض المرض، وتستخدم لتقييم الأدوية المضادة للفيروسات. لدراسة العدوى HSV في TISSUمستوى البريد، وقد طبقت عضوي النمط نماذج الجلد البشري. كما أن معدل الإصابة يقتصر في هذه الثقافات طوف، وقد تم نشر سوى عدد محدود من الدراسات التحقيق العدوى، وانتشار الفيروس وآثار المكونات المضادة للفيروسات 3-6. من أجل توصيف محددات الخلوية التي تلعب دورا خلال العدوى HSV-1 في ظهارة سليمة، أنشأنا بروتوكول لالسابقين الدراسات المجراة إصابة البشرة الفئران 7. تم إعداد البشرة من الأطفال حديثي الولادة أو من ذيول فئران بالغة. منذ HSV-1 لا يمكن أن تصيب عينات الجلد كاملة، والتي كانت غارقة في المتوسط ​​المحتوية على الفيروس، انفصلنا البشرة من الأدمة من قبل dispase II العلاج. بعد تعويم ورقة البشرة في المتوسط ​​المحتوية على الفيروس والخلايا المصابة يمكن تصور في طبقة البشرة القاعدية في مختلف الأوقات بعد العدوى (بي) 7. لتصور الشروع في العدوى في الخلايا الفردية قبل تكاثر الفيروس لالثاني إنتاج الفيروس، ونحن ملطخة أجسام مضادة ضد بروتين الخلية المصابة 0 (ICP0)، التي تعد واحدة من البروتينات الأولى أعرب خلال العدوى HSV-1. توطين الخلوية من ICP0 يمر عبر مراحل متميزة خلال العدوى في وقت مبكر. في حين ICP0 موجود في بؤر النووي خلال مرحلة مبكرة من الفيروسية التعبير الجيني، إعادة المركزية من ICP0 إلى السيتوبلازم يشير إلى مرحلة لاحقة للإصابة 8. استخدمنا خارج الجسم الحي الفحص إصابة أوراق البشرة من نماذج مختلفة الماوس لاختبار الدور المحتمل لمختلف العوامل الخلوية خلال العدوى. لمعالجة آثار RAC1 كمنظم رئيسي للديناميات الأكتين، ونحن إصابة البشرة من الفئران مع حذف الخلايا الكيراتينية محددة من الجين RAC1 9. هذا النموذج يسمح لنا لدراسة الآثار المترتبة على نقص RAC1 على كفاءة العدوى HSV-1 في طبقات البشرة الخلايا الكيراتينية. وبالمقارنة مع البشرة المصابة من تتزاحم التحكم إعادةvealed لا يوجد فرق كبير، مشيرا إلى أن غياب RAC1 لم يكن لها تأثير على بدء الإصابة في الطبقة القاعدية من البشرة 7. استخدام المزيد من نماذج الماوس سمح لنا لمعالجة المستقبلات الخلوية التي تتوسط دخول إلى البشرة. اصابة أوراق البشرة من أي nectin-1- أو الفئران التي تعاني من نقص HVEM مع HSV-1 كشفت أن دخول الفيروس الأولي في الأنسجة تعتمد بقوة على وجود nectin-1 10. وعلاوة على ذلك، تظهر نتائجنا أن HVEM يمكن أيضا أن تكون بمثابة مستقبلات في البشرة الفئران، على الرغم من أن أقل كفاءة من nectin-1 10. لمعالجة التوزيع المكاني للخلايا المصابة في طبقات البشرة، ونحن تصور التعبير ICP0 في قطاعات النسيج والبشرة يتصاعد كلها (الشكل 1). في cryosections من الجلد الكامل، يتم الكشف عن أي خلايا في التعبير عن ICP0 (الشكل 1). في المقابل، cryosections من أوراق البشرة تثبت حشويةالتعبير ICP0 في الطبقة القاعدية بالفعل في 3 ساعات بي (الشكل 1). في أوقات لاحقة، نشر الفيروسية لsuprabasal طبقات يمكن تصور. التوزيع المكاني للخلايا المصابة في الطبقة القاعدية يمكن اتباعها بسهولة في البشرة يتصاعد كلها (الشكل 1). على العدوى مع HSV-1 في 100 PFU / الخلية، ما يقرب من 50٪ من الخلايا الكيراتينية القاعدية في البشرة البيني تظهر التعبير ICP0 في 1.5 ساعة بي عند هذه النقطة الوقت معظم الخلايا المصابة تعبر عن ICP0 النووي. وإعادة المركزية من ICP0 إلى السيتوبلازم يشير إلى مرحلة لاحقة من أوائل التعبير الجيني موجودة في جميع الخلايا تقريبا في 3 ساعة بي (الشكل 1). هذه الأنماط من تصور الخلايا المصابة على فيفو السابقين HSV-1 العدوى توفر فحص قوية لدراسة تأثير مثبطات أو حذف / المكونات الخلوية متحولة على دخول الفيروس وانتشاره في الأنسجة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/high glucose/GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td align="right">31966047</td>
			<td>needed for cultivation of epidermal sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase II powder</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">4942078001</td>
			<td>has to be solved in heated PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzyme-free cell dissociation solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5914</td>
			<td>needed for very gentle dissociation of epidermal sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select cell dissociation solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12563-029</td>
			<td>needed for dissociation of epidermal sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chelex 100 resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>142-2832</td>
			<td>needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gelatin from cold water fish skin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7765</td>
			<td>needed for minimization of non-specific antibody binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-155P</td>
			<td>used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>used as secondary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21429</td>
			<td>used as secondary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (conc.: 0.1 mg/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">36670</td>
			<td>used to counterstain the nucleus</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo infection of murine epidermis with herpes simplex virus type 1

للدخول المضيف البشري، نوع فيروس الهربس البسيط 1 (HSV-1) يجب التغلب على حاجز الأسطح المخاطية والجلد، أو القرنية. HSV-1 الأهداف الكيراتينية خلال الدخول الأولي، ويضع العدوى الأولية في الظهارة، والتي تبعتها العدوى الكامنة من الخلايا العصبية. بعد تنشيط، يمكن أن الفيروسات تصبح واضحة في مواقع المخاطية الجلدية التي تظهر حويصلات أو قرحات الجلد المخاطية. كيف يغزو HSV-1 الجلد أو الغشاء المخاطي، ويصل غير مفهومة مستقبلاته. للتحقيق في الطريق غزو HSV-1 في أنسجة البشرة على المستوى الخلوي، أنشأنا فيفو السابقين نموذج إصابة البشرة الفئران، وهو ما يمثل الموقع من العدوى الأولية والمتكررة في الجلد. ويشمل الفحص إعداد الجلد الفئران. يتم فصل البشرة من الأدمة عن طريق العلاج dispase الثاني. بعد تعويم ورقة البشرة على المتوسطة التي تحتوي على الفيروس، والنسيج هو ثابت ويمكن تصور العدوى في مختلف الأوقات بعد العدوى عن طريقتلطيخ الخلايا المصابة مع الأجسام المضادة ضد HSV-1 الفوري في وقت مبكر من البروتين ICP0. معربا عن ICP0 الخلايا يمكن ملاحظتها في طبقة الخلايا الكيراتينية القاعدية بالفعل في 1.5 ساعة بعد العدوى. مع أوقات أطول العدوى، تم الكشف عن الخلايا المصابة في طبقات suprabasal، مشيرا إلى أن العدوى لا يقتصر على الخلايا الكيراتينية القاعدية، ولكن الفيروس ينتشر إلى الطبقات الأخرى في الأنسجة. باستخدام أوراق البشرة من نماذج الماوس المختلفة، وبروتوكول العدوى يسمح تحديد إشراك المكونات الخلوية التي تساهم في HSV-1 إلى غزو الأنسجة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الاختبار هو مناسبة لاختبار مثبطات في الأنسجة التي تتداخل مع خطوات دخول الأولية، وانتشار الخلايا إلى الخلايا وإنتاج الفيروس. هنا، نحن تصف خارج الجسم الحي بروتوكول الإصابة بالتفصيل وتقديم النتائج لدينا باستخدام الفئران nectin-1- أو HVEM ناقصة.

التحدي المتمثل في طريقة لإعداد ورقة البشرة في الذي HSV-1 يمكن ان تخترق من الطبقة القاعدية. الخطوة الحاسمة هي انفصال البشرة عن الأدمة من قبل dispase II العلاج، والتي، اعتمادا على سلالة الماوس، يجب تكييفها. تركيز dispase الثاني يمكن أن تتراوح 2،5-5 ملغ / مل، والوقت من الحضانة 20-45 دق?...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1 at JoVE.com

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

العدوى فيفو السابقين الفئران البشرة مع فيروس الهربس البسيط من النوع 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

ex-vivo-infection-of-murine-epidermis-with-herpes-simplex-virus-type-1

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

11.0K Views.  University of Cologne. The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

Video: Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

التصوير خارج الحي من خلايا تي في الفئران شرائح العقدة الليمفاوية مع Widefield ومجاهر متحد البؤر

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent reactivation events that ensure transmission and contribute to clinical disease. Current antivirals do not impact the latent reservoir and there are no vaccines. While the molecular details of lytic replication are well-characterized, mechanisms controlling latency in neurons remain elusive. Our present understanding of latency is derived from in vivo studies using small animal models, which have been indispensable for defining viral gene requirements and the role of immune responses. However, it is impossible to distinguish specific effects on the virus-neuron relationship from more general consequences of infection mediated by immune or non-neuronal support cells in live animals. In addition, animal experimentation is costly, time-consuming, and limited in terms of available options for manipulating host processes. To overcome these limitations, a neuron-only system is desperately needed that reproduces the in vivo characteristics of latency and reactivation but offers the benefits of tissue culture in terms of homogeneity and accessibility.
Here we present an in vitro model utilizing cultured primary sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG) (Figure 1) to study HSV-1 latency and reactivation that fits most if not all of the desired criteria. After eliminating non-neuronal cells, near-homogeneous TrkA+ neuron cultures are infected with HSV-1 in the presence of acyclovir (ACV) to suppress lytic replication. Following ACV removal, non-productive HSV-1 infections that faithfully exhibit accepted hallmarks of latency are efficiently established. Notably, lytic mRNAs, proteins, and infectious virus become undetectable, even in the absence of selection, but latency-associated transcript (LAT) expression persists in neuronal nuclei. Viral genomes are maintained at an average copy number of 25 per neuron and can be induced to productively replicate by interfering with PI3-Kinase / Akt signaling or the simple withdrawal of nerve growth factor1. A recombinant HSV-1 encoding EGFP fused to the viral lytic protein Us11 provides a functional, real-time marker for replication resulting from reactivation that is readily quantified. In addition to chemical treatments, genetic methodologies such as RNA-interference or gene delivery via lentiviral vectors can be successfully applied to the system permitting mechanistic studies that are very difficult, if not impossible, in animals. In summary, the SCG-based HSV-1 latency / reactivation system provides a powerful, necessary tool to unravel the molecular mechanisms controlling HSV1 latency and reactivation in neurons, a long standing puzzle in virology whose solution may offer fresh insights into developing new therapies that target the latent herpesvirus reservoir.

The protocol describes an efficient and reproducible model system to study herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latency and reactivation. The assay employs homogenous sympathetic neuron cultures and allows for the molecular dissection of virus-neuron interactions using a variety of tools including RNA interference and expression of recombinant proteins.

والثقافة الخلية العصبية الأولية نظام لدراسة فيروس العقبول البسيط الكمون وإعادة تنشيط

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

عزل تدفق Cytometric من نوع خلايا الفئران الابتدائية السنخية II طلائي للدراسات الوظيفية والجزيئية

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host immune system has experienced in the recent past. DTH reactions are often divided into a sensitization phase, referring to the initial antigen experience, and a challenge phase, which usually follows several days after sensitization. The lack of a delayed-type hypersensitivity response to a recall Ag demonstrated by skin testing is often regarded as an evidence of anergy. The traditional DTH assay has been effectively used in diagnosing many microbial infections.
Despite sharing similar immune features such as lymphocyte infiltration, edema, and tissue necrosis, the direct DTH is not a feasible diagnostic technique in transplant patients because of the possibility of direct injection resulting in sensitization to donor antigens and graft loss. To avoid this problem, the human-to-mouse "trans-vivo" DTH assay was developed 1,2. This test is essentially a transfer DTH assay, in which human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and specific antigens were injected subcutaneously into the pinnae or footpad of a na&iuml;ve mouse and DTH-like swelling is measured after 18-24 hr 3. The antigen presentation by human antigen presenting cells such as macrophages or DCs to T cells in highly vascular mouse tissue triggers the inflammatory cascade and attracts mouse immune cells resulting in swelling responses. The response is antigen-specific and requires prior antigen sensitization. A positive donor-reactive DTH response in the Tv-DTH assay reflects that the transplant patient has developed a pro-inflammatory immune disposition toward graft alloantigens.
The most important feature of this assay is that it can also be used to detect regulatory T cells, which cause bystander suppression. Bystander suppression of a DTH recall response in the presence of donor antigen is characteristic of transplant recipients with accepted allografts 2,4-14. The monitoring of transplant recipients for alloreactivity and regulation by Tv-DTH may identify a subset of patients who could benefit from reduction of immunosuppression without elevated risk of rejection or deteriorating renal function.
A promising area is the application of the Tv-DTH assay in monitoring of autoimmunity15,16 and also in tumor immunology 17.

We describe a valuable diagnostic assay that could potentially be used to decide the withdrawal of immunosuppression after transplant without elevated risk of graft rejection. The assay uses the principles of Delayed Type Hypersensitivity and provides accurate assessment of both donor specific effector and regulatory immune responses mounted by recipients.

عبر الجسم الحي فرط الحساسية النوع المتأخر الفحص ل Antigen تنظيم محدد

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

تقييم فعالية وسمية الرنا استهداف HIV-1 الإنتاج للاستخدام في الجينات أو العلاج بالعقاقير

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under controlled laboratory conditions. Ex vivo infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV), among other viruses, has been successfully used to investigate early disease pathogenesis, as well as a platform to test the efficacy and toxicity of antiviral drugs. In the present protocol, we explain how to process and infect with HIV-1 tissue explants from human tonsils and cervical mucosae, and maintain them in culture on top of gelatin sponges at the liquid-air interface for about two weeks. This non-polarized culture setting maximizes access to nutrients in culture medium and oxygen, although progressive loss of tissue integrity and functional architectures remains its main limitation. This method allows monitoring HIV-1 replication and pathogenesis using several techniques, including immunoassays, qPCR, and flow cytometry. Of importance, the physiologic variability between tissue donors, as well as between explants from different areas of the same specimen, may significantly affect experimental results. To ensure result reproducibility, it is critical to use an adequate number of explants, technical replicates, and donor-matched control conditions to normalize the results of the experimental treatments when compiling data from multiple experiments (i.e., conducted using tissue from different donors) for statistical analysis.

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV) ex vivo provides a valuable 3D model of virus pathogenesis. Here, we describe a protocol to process and infect tissue specimens from human tonsils and female genital mucosae with HIV-1 and maintain them in culture at the liquid-air interface.

السابقين فيفو التهاب الغشاء المخاطي للأعضاء التناسلية أنثى والأنسجة اللمفاوية البشرية مع فيروس نقص المناعة البشرية 1 وهيستوكولتوري

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

نموذج السابقين فيفو الابتدائي بورسال خلية ثقافة دجاج لدراسة الأمراض المعدية بورسال الفيروسات المرضية

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.

التحليل الزمني إزفاء النووية إلى هيولى بروتين الفيروس 1 الحلأ البسيط بالفحص المجهري [كنفوكل] إيمونوفلوريسسينت

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, such as type 2 diabetes and nonalcoholic steatohepatitis (NASH). Recent research has established that pro-inflammatory immune cells infiltrate obese hypertrophic adipose tissue and liver. Given the emerging importance of immune cells in the context of metabolic homeostasis, there is a critical need to quantify and characterize their modification during the development of type 2 diabetes and NASH. However, animal models that induce pathophysiological features typical of human NASH are sparse.
In this article, we provide a detailed protocol to identify immune cell subsets isolated from liver and adipose tissue in a reliable mouse model of NASH, established by housing high-fat diet (HFD) mice under non-specific pathogen-free (SPF) conditions without a barrier for at least seven weeks. We demonstrate the handling of mice in non-SPF conditions, digestion of the tissues and identification of macrophages, natural killer (NK) cells, dendritic cells, B and T cell subsets by flow cytometry. Representative flow cytometry plots from SPF HFD mice and non-SPF mice are provided. To obtain reliable and interpretable data, the use of antibodies, accurate and precise methods for tissue digestion and proper gating in flow cytometry experiments are critical elements.
The intervention to restore physiological antigen exposure in mice by housing them in non-SPF conditions and unspecific exposure to microbial antigens could provide a relevant tool for investigating the link between immunological alterations, diet-induced obesity and related long term complications.

A simple and reliable diet-induced rodent animal model for nonalcoholic steatohepatitis (NASH) is described, achieved through non-SPF housing of the animals and administration of a specific high-fat diet. We describe identification of hepatic and adipose immune cell subsets to recapitulate human immunological conditions by exposing mice to environmental germs.

نموذج Murine متقدم للتهاب الكبد غير الكحولية بالتعاون مع مرض السكري من النوع 2

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

في اختبار فيترو ELISA لتقييم قوة لقاح داء الكلب

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...