فحص المركبات العضوية الصغيرة تسمى شظايا باستخدام التصوير البلوري بالأشعة السينية هو وسيلة فعالة لتحديد الجزيئات التي هي نقاط انطلاق لاكتشاف المخدرات أو تطوير مركب أداة كيميائية حيوية. لم يكشف فحص الأجزاء البلورية عن الهوية فحسب، بل كشف أيضا عن مكان وكيفية ربط الشظايا على سطح البروتين قيد الدراسة. يمكن استخدام هذه التقنية على كل هدف البروتين ذات الصلة بيوكيميائية أو طبية التي يمكن أن تزرع بلورات البروتين مناسبة.
ترتبط جودة النتائج ارتباطا وثيقا بجودة معالجة العينة. ونحن نعتقد أن العرض البصري التالي سيساعد الباحثين على إجراء تجارب عالية الجودة. إثبات الإجراء سيكون تاتيانا بارتيل، باحثة دكتوراه وطالبة دكتوراه في مختبري.
للبدء، قطع فتح كيس لوحة الفحص مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة، ثم إزالة الغطاء واحباط من لوحة الفحص. decant محلول نقع ملليلتر خمسة في خزان كاشف. ثم ملء كل من 96 خزانا من لوحة مع 40 ميكرولتر من محلول نقع باستخدام ماصة قناة 12.
ضع إطار الوصول السهل أعلى لوحة الفحص وقم بتأمينه باستخدام المشابك المضمنة عن طريق تمريرها إلى الجانب الأيسر والأيمن من الجهاز. ضع لوحة الفحص وإطار الوصول السهل تحت المجهر وانزلق فتح البئر الأول عن طريق تحريك البلاط الزجاج الاكريليك كل من الإطار. إضافة 0.4 ميكرولتر من محلول نقع من الخزان إلى جزء يحتوي على بئر باستخدام طرف ماصة جديدة.
تأكد من أن قطرة يغطي جزء المجففة على. ضع لوحة التبلور التي تحتوي على أكبر بلورات تحت المجهر الثاني وقطع فتح احباط الختم في واحدة من الآبار. باستخدام حلقة الحجم المناسب، نقل الكريستال إلى بئر لوحة الفحص تحت المجهر الأول.
غسل حلقة في لوحة بقعة الزجاج المعدة، ثم تجفيفه عن طريق لمس بلطف إلى الأنسجة. القيام بذلك بعد كل نقل لتجنب التلوث المتبادل. استخدم المجهر لضمان وضع البلورة بشكل صحيح.
كرر الإجراء للبلورة الثانية. الانتقال إلى البئر التالي، وتكرار الإجراء لجميع الآبار المتبقية. بعد أن يتم نقل البلورات إلى جميع الآبار ال 96 في لوحة الفحص ، قم بإزالة لوحة الفحص إلى جانب إطار الوصول السهل من تحت المجهر ووضعها على مقاعد البدلاء أو الطاولة.
ثم قم بإزالة إطار الوصول السهل من لوحة الفحص، وختم لوحة الفحص بورق الختم، ووضعها في حاضنة التبلور أو الدولاب لاحتضانها لوقت النقع الأمثل سابقا. ساعتين من الحضانة كافية، ولكن بين عشية وضحاها قد تكون أكثر ملاءمة. إعداد رغوة Unipuck ديوار مع ثلاثة أغطية Unipuck ونصف ملء مع النيتروجين السائل، وإبقائه على الأرض.
نقل ديوار نصف مملوءة إلى مقاعد البدلاء، وملئه تماما إلى الحافة جدا. يبقيه شغلها إلى الحافة العليا خلال التجربة بأكملها، واستبدال النيتروجين السائل في كثير من الأحيان. استرداد لوحة الفحص من الحاضنة وإزالة احباط لها.
ضع إطار الوصول السهل في الأعلى. الشريحة فتح البئر الأول. حصاد بلورة واحدة من قطرة وفلاش تبريده في النيتروجين السائل عن طريق الغطس مع حركة عمودية سريعة.
إدراج العينة في موقف عفريت السليم، وتدوين الملاحظات ذات الصلة على ورقة تتبع العينة. كرر الإجراء للبلورة الثانية. الذهاب إلى البئر التالي وتكرار تحديد المواقع من بلورات أخرى حتى جميع الصولجانات الثلاثة كاملة.
قبل تبريد قواعد Unipuck في النيتروجين السائل، وإضافتها على رأس الأغطية. تخزين Unipucks في رف التخزين في ديوار النقل أو ديوار التخزين. الاحتفاظ بها في النيتروجين السائل في درجات حرارة المبردة حتى القياس.
كرر نفس الإجراء من حصاد وتخزين بلورات في Unipucks للعينات المتبقية في لوحة الفحص. يظهر هنا تنوع مورفولوجيا الكريستال بعد إجراء نقع الشظايا وحصاد الكريستال. حتى بلورات التي تبدو تدهورت إلى حد ما وشملت، لأنها لا تزال تؤدي إلى بيانات مفيدة.
تم جمع البيانات في خطوط الحزم 14.1 و 14.2 في السنكروترون BESSY II. تم تنفيذ جمع بيانات الحيود لكل عينة. تم تحليل البيانات باستخدام FragMAXapp ، مع التركيز على الجمع بين XDSAPP للمعالجة ، fspipeline لصقل الهيكل ، وPenDA للعثور على ضرب.
وأدى ذلك إلى 15 يضرب على مجمع البروتين AR باستخدام حالة نقع خالية DMSO. في حملة سابقة من شاشة الدخول F2X ضد نفس الهدف ، بما في ذلك DMSO في حالة النقع ، تم العثور على 20 زيارة. وهذا يعني أنه يمكن تحديد 75٪ من الزيارات إذا تم حذف DMSO.
لنجاح التجربة ، من الأهمية بمكان أن يتم التعامل مع البلورات بشكل صحيح وبعناية خلال كل خطوة من خطوات الإجراء. وقد نضج فحص الشظايا البلورية إلى تقنية تستخدم على نطاق واسع، والتي غالبا ما تطبق في الأوساط الأكاديمية وفي صناعة الأدوية.
