엑스레이 결정학을 사용하여 단편에게 불린 더 작은 유기 화합물의 검열은 약 발견 또는 생화확적인 공구 화합물 발달을 위한 출발점인 분자를 확인하는 능률적인 방법입니다. 결정화 단편 스크리닝은 정체성뿐만 아니라 연구 하에 단백질 표면에 파편이 어디에 어떻게 결합되는지를 밝혀냈습니다. 이 기술은 적합한 단백질 결정이 재배될 수 있는 모든 생화학적 또는 의학적으로 관련있는 단백질 표적에 사용될 수 있습니다.
결과의 품질은 샘플 처리의 품질에 밀접하게 연결됩니다. 우리는 다음과 같은 시각적 데모가 연구원이 고품질의 실험을 수행하는 데 도움이 될 것이라고 믿습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 연구원이자 박사 과정 학생인 Tatjana Barthel이 될 것입니다.
시작하려면, 실온에 미리 따뜻하게 스크리닝 플레이트의 가방을 열고, 다음 검사 플레이트에서 뚜껑과 호일을 제거합니다. 시약 저장소에 5 밀리리터 담그용 용액을 데산합니다. 그런 다음 12 채널 파이펫을 사용하여 40 마이크로 리터의 담그용으로 플레이트의 96 개의 저수지를 채웁니다.
스크리닝 플레이트 위에 쉽게 접근할 수 있는 프레임을 배치하고 장치의 왼쪽과 오른쪽으로 슬라이딩하여 포함된 클램프로 고정합니다. 스크리닝 플레이트와 현미경 아래에 쉽게 접근할 수 있는 프레임을 놓고 프레임의 각각아크릴 유리 타일을 이동하여 첫 번째 우물을 엽니다. 0.4 마이크로리터의 침을 흡수용 용액을 저수지에서 신선한 파이펫 팁을 사용하여 잘 함유된 조각에 추가합니다.
드롭이 말린 조각을 덮는지 확인합니다. 제2 현미경 아래에 가장 큰 결정이 포함된 결정화 플레이트를 놓고 우물 중 하나에서 밀봉 호일을 열어 놓습니다. 적절한 크기의 루프를 사용하여 첫 번째 현미경하에서 스크리닝 플레이트의 우물로 크리스탈을 전달합니다.
준비된 유리 반점 플레이트에서 루프를 씻은 다음 조직에 부드럽게 만져 서 말리십시오. 교차 오염을 피하기 위해 모든 전송 후이 작업을 수행합니다. 현미경을 사용하여 결정이 제대로 배치되었는지 확인합니다.
두 번째 결정에 대한 절차를 반복합니다. 다음 우물로 이동하고 남아있는 모든 우물에 대한 절차를 반복합니다. 결정이 스크리닝 플레이트의 모든 96개의 우물로 옮겨진 후, 현미경 아래에서 쉽게 접근할 수 있는 프레임과 함께 스크리닝 플레이트를 제거하고 벤치 나 테이블에 놓습니다.
그런 다음 스크리닝 플레이트에서 쉽게 접근할 수 있는 프레임을 제거하고, 스크리닝 플레이트를 밀봉 호일로 밀봉하고, 이전에 최적화된 담그기 시간 동안 배양하기 위해 결정화 인큐베이터 또는 찬장에 배치한다. 2시간 의 배양으로 충분하지만 하룻밤이 더 편리 할 수 있습니다. 유니퍽 폼 드와르를 유니퍽 뚜껑 3개와 함께 준비하고 절반은 액체 질소로 채우며 땅에 보관합니다.
반쯤 채워진 드와르를 벤치로 옮기고 완전히 가장자리로 채웁니다. 전체 실험 중에 상부 모서리에 채우고 액체 질소를 자주 교체하십시오. 인큐베이터에서 스크리닝 플레이트를 검색하고 호일을 제거합니다.
쉽게 접근할 수 있는 프레임을 위에 놓습니다. 첫 번째 우물을 엽니다. 드롭에서 하나의 크리스탈을 수확하고 빠른 수직 움직임으로 급락하여 액체 질소로 냉각.
샘플을 적절한 퍽 위치에 삽입하고 샘플 추적 시트에 관련 메모를 작성합니다. 두 번째 결정에 대한 절차를 반복합니다. 다음 우물로 가서 세 개의 퍽이 모두 가득 차날 때까지 다른 결정의 위치를 반복하십시오.
액체 질소에 Unipuck 기지를 미리 냉각하고 뚜껑 위에 추가합니다. 유니퍽을 저장 선반에 보관하여 데와르 또는 스토리지 드와르에 보관하십시오. 측정될 때까지 극저온 온도에서 액체 질소를 보관하십시오.
스크리닝 플레이트에 남아 있는 시료에 대해 유니퍽에 크리스탈을 수확하고 저장하는 동일한 절차를 반복합니다. 파편담그고 결정 수확을 수행한 후 결정 형태학의 가변성이 여기에 도시된다. 다소 악화된 것처럼 보이는 결정조차도 여전히 유용한 데이터를 생성하기 때문에 포함되었습니다.
데이터는 BESSY II 싱크로트론에서 빔라인 14.1 및 14.2에서 수집되었다. 회절 데이터 수집은 각 샘플에 대해 수행되었습니다. 이 데이터는 FragMAXapp을 사용하여 분석되었으며 처리를 위한 XDSAPP, 구조 개선을 위한 fspipeline 및 적중 발견을 위한 PenDA의 조합에 중점을 두였습니다.
이로 인해 DMSO 무료 담그기 조건을 사용하여 AR 단백질 복합체에서 15개의 안타를 기록했습니다. DMSO를 포함한 동일한 대상에 대한 F2X 엔트리 스크린의 이전 캠페인에서 20개의 조회수가 발견되었습니다. 즉, DMSO가 생략된 경우 조회수의 75%를 식별할 수 있습니다.
실험의 성공을 위해, 결정은 절차의 모든 단계에서 적절하고 신중하게 처리되는 것이 중요합니다. 결정성 단편 스크리닝은 학계와 제약 산업에서 종종 적용되는 널리 사용되는 기술로 성숙해졌습니다.
